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1、端粒酶逆转录酶在急性坏死性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡中的作用SAP是由胰腺局部炎症所致，累及全身炎症反应综合征，继而造成多器官功能障碍综合征的临床危重病。“白细胞过度激活学说”是SAP发病的重要机制之一。胰腺组织自身消化释放内源性物质，激活中性粒细胞，使得其凋亡延迟，继而释放大量炎症因子，引发“瀑布”效应，致使SAP患者出现全身炎症反应综合征。传统观点认为，端粒酶逆转录酶(teIomerasereversetranscriptase,TERT)仅在肿瘤细胞、生殖细胞、造血细胞中表达。2008年1.ePre1.1.X等首次发现TERT在中性粒细胞胞质中表达。近年有研究报道，冠心病、原发性卵巢功能不
2、全患者中性粒细胞TERT水平异常表达，中性粒细胞凋亡延迟，但迄今为止，未见SAP时中性粒细胞TERT表达水平的相关报道。因此，本研究探讨TERE对急性坏死性胰腺炎(acutenecrotizingpancreatitis,ANP)大鼠中性粒细胞凋亡的影响。材料与方法一、动物与分组24只SPF级Sprague-Daw1.ey雄性大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(沪)2017-0005。大鼠禁食12h,自由饮水，按数字表法随机分为正常对照组，ANP3、6h组和TERT抑制剂BIBRI532干预组(BIBRI532组),每组6只。ANP组大鼠采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠（1
3、m1.kg）造模，分别在造模后3、6h处死，经心脏采血。BIBRI532组大鼠在造模前腹腔注射2mg/kgTERT抑制剂BIBR1532（美国EMC公司），每周3次，连续2周，于造模3h后处死，经心脏采血。正常对照组大鼠未经任何处理。取各组大鼠胰腺组织，置10%甲醛溶液中固定。二、方法1 .外周血中性粒细胞分离：采集的大鼠血样本经1%葡聚糖沉淀红细胞，取上层富含粒细胞的血浆，按1：1容积加入大鼠淋巴细胞分离液，以1500rmin离心20min,离心半径9cmo通过低渗溶液溶解红细胞，Perco1.I密度梯度离心法分离中性粒细胞，采用台盼蓝、瑞氏染色检测中性粒细胞存活率和纯度。2 .中性粒细胞T
4、ERTmRNA检测：应用荧光定量PCR法检测中性粒细胞的TERTmRNA表达量。TERT正向引物序列为5,-CAGATGCGACCCCTATTC-3,反向引物序列为5,-TGTAACCGGAGCAAACTC-3内参GAPDH正向引物序列为5-TATCGGACGCCTGGTTAC-3,反向引物序列为5,-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3,。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。反应条件：9510min,9515s、6015s,40个循环。通过仪器自带软件获取Ct值，以公式2ACt计算mRNA相对表达量。3 .中性粒细胞TERT蛋白及凋亡相关蛋白检测：采用蛋白质免疫印迹法检测TERT
5、蛋白及凋亡相关蛋白Bc-1.Bax表达量。抗TERT、Bc-1.BaX单克隆抗体购自英国abeam公司，工作浓度均为1：1000;辣根过氧化物酶标记的二抗购自上海碧云天生物技术有限公司，工作浓度为1:200o最后EC1.发光，X片曝光、显影、定影。ImageJ软件分析各条带灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比为蛋白相对表达量。4 .中性粒细胞凋亡检测：取含2X106/m1.中性粒细胞的RPM1.1.640培养液500I,均匀接种于24孔板，常规培养16h后，依次加入2.5IAnnexinV-FITC和5.0IJ1.1.碘化丙咤(PI)溶液，上流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡。5 .血清TNF-q
6、、I1.-6检测：收集与分离大鼠外周血血清，E1.ISA检测试剂盒(美国eBioScience公司)检测各组大鼠血清TNF-Q、I1.-6水平，按试剂盒说明书操作。6 .胰腺组织病理学检查：取甲醛溶液固定的胰腺组织标本，常规石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察组织病理改变。三、统计学处理应用SPSS20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用xs表示，组间比较采用独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。一、各组大鼠中性粒细胞TERTmRNA及蛋白的表达分离后的大鼠中性粒细胞瑞氏染色显示细胞核呈杆状或25分叶状，符合中性粒细胞特征，纯度95%（图1A）;台盼蓝染色显
7、示极少量细胞呈淡蓝色，中性粒细胞存活率97%（图IB）O图1外周血中性粒细胞特征IA瑞氏染色（IO（X）;IB台盼蓝染色（00）正常对照组、ANP3h组、ANP6h组、BIBRI532组外周血中性粒细胞TERTmRNA表达量分别为1.030.26、3.311.07.5.210.78、1.950.49,TERT蛋白表达量分别0.090.03.0.430.12,0.580.110.220.07（02）,ANP3、6h组TERTmRNA及蛋白表达水平高于正常对照组，而BIBRI532组低于ANP3h组，差异均有统计学意义（t值分别为5.08、12.52、2.82,6.92、7.69、4.05;P值均
8、0.05）o表明TERTmRNA及蛋白在ANP大鼠外周血中性粒细胞中高表达。1TERT注:A、P为急性坏死性胰腺炎;TERT为端粒的逆转录的；B1BRI532为端粒的逆转录地抑制剂图2正常对照组（1）、ANP 3 h组（2）、ANp 6 h组（3）、B1BR1532组（4 ）大鼠外周血中性粒细胞TERT蛋白表达GAPDH二、各组大鼠中性粒细胞Bc1.-x1.、BaX蛋白的表达正常对照组、ANP3h组、ANP6h组、BIBRI532组中性粒细胞的BC粒X1.蛋白表达量分别为O.190.05.0.500.07.0.850.04、0.400.11,BaX蛋白表达量分别0.29士0.08、0.230.
9、03、0.170.02.0.430.12（图3）。与正常对照组比较，ANP3、6h组的Bc1.-x1.表达量上升（t值分别为7.75、16.30,P值均0.05）,而BaX表达量下降（t值分别为4.22、6.74,P值均0.05）;与ANP3h组比较，BIBR1.532组Bc1.x1.表达量下降（t=5.42,P0.05）,而BaX表达量上升（t=5.59,P6hff1.(4C).BIBfU532ff1.(4D)大就外用血中性於细胞流式细胞分析图三、各组大鼠中性粒细胞凋亡率中性粒细胞体外培养16h后，正常对照组、ANP3h组、ANP6h组、BIBR1.532组外周血中性粒细胞凋亡率分别为(10
10、.030.74)%、(7.990.27)%、(6.650.36)%、(22.982.86)%oANP3、6h组中性粒细胞凋亡率低于正常对照组，而BIBRI532组高于ANP3h组，差异均有统计学意义(t值分别为4.52、7.27、12.63,P值均0.05,图4)o四、各组大鼠血清TNF-q、I1.-6水平正常对照组、ANP3h组、BIBR1.532组血清TNF-Q水平分别为(96.6727.12)、(382.3046.33).(206.8836.42)ng1.,I1.-6水平分别为(43.3414.50).(134.2116.13).(88.0613.05)ng1.,ANP3h组TNF-a、
11、I1.-6水平均高于正常对照组，BIBRI532组TNF-q、I1.-6水平均低于ANP3h组，差异均有统计学意义（t值分别为22.57、12.63,17.77、9.43；P值均0,05）。表明TERT高表达可上调血清TNF-、I1.-6水平。五、各组大鼠胰腺组织的病理改变正常对照组大鼠胰腺组织结构完整，无间质充血、出血和腺泡细胞坏死。ANP组大鼠胰腺组织可见大量的炎症细胞浸润，小叶间隔增宽、结构破坏，组织坏死。BIBRI532组大鼠胰腺组织病理改变较ANP组明显改善（图5）o表明TERT高表达可加重ANP大鼠胰腺组织的炎症损伤。注:A、P为急性坏死性腆腺炎；B1.HKI532为端粒解逆转录的
12、抑制剂图5正常对黑纲（5A）、A、P3h组（5B）、AXP6h组（5C）1BH1532组（5D）大鼠腆腺组织病理改变（苏木格-伊红明色x4）讨论端粒酶为自身携带模板的核蛋白逆转录酶，由TERT、端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白3个主要的亚单位组成。端粒酶是细胞凋亡延迟的关键信号分子，通过端粒和非端粒保护机制，维持端粒长度和改善线粒体功能，抑制细胞凋亡。TERT是端粒酶活化的限速酶，其表达程度反映端粒酶活性水平。研究发现，动脉粥样硬化大鼠在持续炎症递质刺激下，其动脉组织的端粒酶活性增加13倍；不稳定型心绞痛患者外周血中性粒细胞端粒酶活性较健康者增加2倍，从动脉粥样硬化患者的硬化斑块分离出的中性粒细胞
13、中端粒酶活性增加更显著，其中35%患者的端粒酶活性增加50倍；原发性卵巢功能不全患者外周血中性粒细胞的端粒酶活性下降3倍,加速细胞衰老过程，进而导致卵巢内卵泡的耗竭或功能失常。2011年VonFigi1.ra等报道端粒酶基因敲除小鼠胰腺外分泌腺的再生能力降低，显示端粒酶参与急性胰腺炎的发生和发展。本研究结果显示，ANP大鼠外周血中性粒细胞的TERTmRNA及蛋白表达上调，细胞凋亡的时间延长，抗凋亡蛋白BC1.-X1.表达水平上升，而促凋亡蛋白BaX表达水平下降，同时外周血TNF-ci、I1.-6等炎症细胞因子水平也显著升高。提示BIBRI532显著下调中性粒细胞的TERTmRNA及蛋白表达，促进中性粒细胞凋亡，降低外周血炎症因子水平，有效缓解ANP大鼠胰腺组织的炎症损伤。然而，本研究未行BIBR1532时间及剂量依赖性效应观察，存在一定的局限性。
