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1、重组结核分枝杆菌Mr38000蛋白的表达、纯化和鉴定摘要从H37Rv基因组中扩增Mr38000蛋白基因并高效表达和纯化。用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增Mr38000蛋白序列，将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coliDH5,构建重组克隆载体pGEM-THEasyMr38000,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coliDH5a,IPTG诱导目的蛋白表达。经WeStern-blot鉴定目的基因与（HiS）6融合表达，将已表达的蛋白质通过Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化。PCR得到结核分枝杆菌Mr38000蛋白基因,测序结果与GeBank中
2、报道的完全一致。SDS-PAGE显示，在Mr为38.5X103处有相应的蛋白质表达条带，WeSernblot鉴定为（HiS）6融合表达蛋白。经Ni-NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白。成功克隆了铁调节蛋白基因Mr38000蛋白序列，并在E.coliDH5高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白。关键词Mr38000蛋白；表达；纯化;结核分枝杆菌；Cloning,ExpressionandPurificationofMr38000proteinfromMycobacteriumtuberculosisZHANGMing,LIJi11-cheng,LINHangDepartmentofint
3、ernalneurology2.emergencydepartment,theFuZhougeneralhospital,FuZhou,350025,P.R.China)AbstractjToobtainMycobacteriumtuberculosisMrBSOOOproteinfromH37Rv-DNA,expressefficientIyinE.ColiandpurifytheMrBSOOOproteins.Mr38000proteingenewasamplifiedbyPCRfromthegenomeofH37RvandclonedintopGEM-T-Easyvector.After
4、sequenced,Mr38000proteingenewasrecombinatedexpressionvectorpQE-SoLbyrestrictionenzymedigestion,namedpQE-80L-Mr38000.TheplasmidpQE_80L-Mr38000wastransformedintoE.coliDH5QandinducedbyIPTG.Mr38000proteinexpressionwasanalyzedbySDS-PAGEandconfirmedbywesternblotwithmice-specificmAbagainst(His)6.Mr38000pro
5、teingenewasidenticalwithGeBankreported.ThepQE-80L-Mr38000ectorexpressedproteInwithrelativemoleculeweightabout38.5kD,Whichcouldbecaughtby(His)6mAb.TheexpressedproteincouldbepurifiedbyNi-NTAsystemkitwithdenativecondition.Mr38000proteingenehadbeensUccessfullyclonedandefficientlyexpressedinE.coli,Theres
6、ultsestablishedthebasisforfurtherstudyofthefunctionofMr38000protein.KeywordsMr38000protein;expression；purification；Mycobacteriumtuberculosis(MTB)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)是结核病(tuberculosis,TB)的病原体。其在患者体内主要为细胞内生长。诊断方法的欠缺是结核病流行的重要原因。目前常用的PPD试验，常使BCG疫苗接种者被误检为阳性1,且对后期结核患者敏感性较低，存在明显不足。近年来，有研究发
7、现Mr38000蛋白具有强的免疫原性，而成为结核分枝杆菌抗原的研究热点2,3,可能成为结核病血清学诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌Mr38000蛋白并对其进行了纯化，为进一步研究其抗原性和主要功能提供方便。1材料和方法1.1材料MTB毒株H37Rv、DH5a由本室保存；pGEM-T-EaSy及WizardpiusPurificationsystem购自Promega公司；X-gal,限制性内切酶BamHI,ECORI及T4-DNA连接酶，TaqDNA聚合酶均为TaKaRa公司产品;IPTG,DTT,DTE,小量质粒提取试剂盒均为Sigma公司产品，胶
8、回收试剂盒为Vitagene公司产品。1.2方法1.2.1引物的设计与合成根据已发表的MTBH37RV全基因组Mr38000蛋白基因序列设计引物。上游引物Pl：5-Aggggatccgcgaaaattcgtttgcatacgct-B,含BanIHI酶切位点和起始密码子，下游引物P2：5-Gatgaattcacggaggttgctgtcgcgtggtg-S中加入ECORI酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。1.2.2Mr38000片段的扩增取保存于改良罗氏培养基的MTBH37Rv接种于7H9液体培养基，37。C间或振荡培养23wk取5mL液体培养物的菌体沉淀重悬于50L裂解液(10PC
9、R绶冲液5UL,45gL吐温,5uL,45gL,NP-405L,20gL蛋白酶K0.5uL及水34.5uL)中。于55水浴Ih,沸水浴IOnIin灭活蛋白酶K,离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于50ULTE中，作为DNA模板。PCR反应体系为：10buffer5L,dNTPs5L(2.5mmoLL).DNA模板为1L,Pl,P2引物各1L(25moLL)及Taq酶1L,加水至50LPCR条件:94C变性40s,60C复性30s,72C延伸1.5min,30个循环。1.2.3PCR产物的克隆与鉴定PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收DNA条带。取纯化的PCR产物与质粒pGEM-T-Easy
10、进行连接反应，转化感受态DH5,均匀涂布于含有x-gal(33L)和异丙基B-D硫代半乳糖昔IPTG(20L)的LB培养皿中，37。C培养16h,挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为pGEM-T-EaSy-Mr38000,送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。1.2.4目的蛋白的诱导表达经BamHI和EcoRI双酶切后与经同样酶切的pQE-80L载体进行连接反应，转化感受态DH5,挑取的阳性克隆命名为pQE-80L-Mr38000o在含有氨节青霉素（100mgL）的LB培养基中过夜培养pQE-80L-Mr38000。按10%的接种量进行转接，37。C摇菌3h,加入异丙基B-D硫代半
11、乳糖昔（IPTG）至终浓度为05mmoLL,37。C继续培养5ho取1.5mL细菌培养物，8000g离心30s收集菌体，加入2样品缓冲液剧烈振荡混匀，10（TC,5min;800Og离心5min;取上清进行SDS-PAGE电泳检测。1. 2.5目的蛋白的Westernblot分析将经诱导的pQE-80L-Mr38000和E.coliDH5a分别制样，进行12%SDS-PAGE后以0.15mA恒流电转2h至硝酸纤维素膜上，用50gL脱脂奶封闭2h,PBS洗涤后加抗HiS的单克隆抗体（1:5000稀释）4。C过夜，PBS洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，37。C孵育lh。PBS洗涤后DAB显
12、色观察结果。1.2.6目的蛋白的可溶性分析大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声破菌。离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDS-PAGE分析。1.2.7目的蛋白的纯化根据Ni-NTA试剂盒的说明书，将融合蛋白与NI-NTA结合，用不同PH值咪嗖溶液进行洗脱，得到纯化产物。2结果2. lMr38000蛋白片段的扩增及序列测定经30个循环PCR扩增，可得与预计长度相等的片断（图1）。将DNA回收后插入pGEM-T-Easy载体，经测序证实所扩增的Mr38000序列与GeBank数据库所收录的Mr38000序列完全一致。M：DNAnIarkerDL2000；LMr38000基因PCR产物；图
13、IPCR扩增Mr38000蛋白基因产物琼脂糖凝胶电泳（10gL）结果2. 2表达载体的构建pQE-80L经BamHI和EcoRI双酶切后与Mr38000基因目的片断进行连接反应后，转化感受态E.coliDH5o挑取的克隆子进行酶切鉴定，切出约1151bp大小片段的为阳性克隆子（图2）,命名为pQE-80L-Mr38000oM：DNAmarkerDL2000;1,2：pQE-80L-Mr38000;图2pQE-80L-Mr38000重组质粒BamHI和EcoRI双酶切鉴定结果2. 3Mr38000蛋白在pQE-80L表达载体中的诱导表达将pQE-80L-Mr38000经37活化过夜，经IPTG诱
14、导表达后做SDS-PAGE分析，从电泳图中可以看出在Mr为38.5103一致处出现了一条表达带，表达量约占菌体总蛋白的20%（图3）oM：蛋白分子量marker；1：未诱导的pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5；2-4：诱导的pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5；图3(His)6-Mr38000融合蛋白的SDS-PAGE分析2.4 目的蛋白的鉴定所构建的重组质粒表达的Mr38000蛋白以带有6个组氨酸的融合蛋白的形式出现，使用鼠抗(HiS)6mAb验证Mr38000蛋白的表达。结果显示在Mr为38.5X103处有一显色带，而对照无相应条带(图4)。M
15、：蛋白分子量marker；1：(His)6-Mr38000proteinexpression2.DH5图4(His)6-Mr38000融合蛋白的Westernblot分析结果2.5 目的蛋白的可溶性分析将上清和沉淀分别所制样品，进行SDS-PAGE分析表明表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中，而上清中则很少(图5)。M：蛋白分子量marker；1：未诱导的PQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5；2：诱导菌超声裂解后沉淀;3：诱导菌超声裂解后上清；图5(His)6-Mr38000融合蛋白的可溶性分析2.6目的蛋白的纯化纯化的产物经SDS-PAGE分析可在Mr为38.5103处得到
16、一条清晰的条带(图6)。M：蛋白分子量marker；1：未诱导的PQE-80L-Mr38000质量重组菌E.coliDH5；2：诱导的pQE-80L-Mr38000质量重组菌E.co1iDH5Q；3,4：(His)6-Mr38000纯化蛋白图6(His)6-Mr38000融合蛋白的表达及纯化3讨论Mr38000蛋白是一种磷酸盐转运蛋白，含有对结核分枝杆菌特异单克隆抗体定位的7个表位，具有较强的抗原性，已经得到了结核病研究学者们的一致认可。1992年，BothanIley4等认为Mr38000蛋白是研究菌阴性肺结核最有用的抗原之一。2006年Mark5等通过蛋白质基因芯片和病人血清筛选，发现Mr38000蛋白是空洞性肺结核所特有的蛋白抗原。本实验中应用的pQE-80L表达
