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1、梅毒实验室诊断技术及梅毒实验室诊断技术及梅毒实验室检测技术规范简介梅毒实验室检测技术规范简介n背景介绍背景介绍n梅毒实验室检测技术梅毒实验室检测技术n梅毒血清学试验检测技术进展梅毒血清学试验检测技术进展n梅毒实验室检测策略探讨梅毒实验室检测策略探讨n梅毒检测技术规范（上报稿）简介梅毒检测技术规范（上报稿）简介主要内容主要内容背景介绍背景介绍（一期和二期梅毒更加真实反映梅毒疫情趋势）（一期和二期梅毒更加真实反映梅毒疫情趋势）全国梅毒流行状况全国梅毒流行状况研究点首次调查人数梅毒感染梅毒感染者中HIVHIV感染人数率%人数率%人数率%常州4136215.01016.11013.3扬州4951653
2、3.32817.07314.7深圳53315228.51912.5417.7广州310206.555/20134.2合计175139922.86215.51377.85MSMMSM人群梅毒和人群梅毒和HIVHIV感染率感染率n卫生部于卫生部于20102010年年6 6月月3 3日下发了日下发了关于关于中国预防与控制梅毒规中国预防与控制梅毒规划（划（2010-20202010-2020年）年）n卫生部卫生部20112011年年2 2月月1212日下发日下发预预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播工作实施方案播工作实施方案n整合到国务院即将下发的整合到国务院即将下发的中中国预防控
3、制艾滋病五年行动计国预防控制艾滋病五年行动计划（划（21011-201521011-2015年）年）6卫生部下发相关政策卫生部下发相关政策/规划文件规划文件主要措施：主要措施：n广泛开展宣传教育，普及梅毒防治知识广泛开展宣传教育，普及梅毒防治知识n开展综合防治，阻断梅毒传播开展综合防治，阻断梅毒传播n提高监测检测质量，开展主动检测，促进梅毒早期发现提高监测检测质量，开展主动检测，促进梅毒早期发现n提供规范化梅毒医疗服务提供规范化梅毒医疗服务n预防和控制先天梅毒预防和控制先天梅毒n加强国际合作和应用性研究加强国际合作和应用性研究 围绕围绕规划规划防控策略，提出相应的工作设想防控策略，提出相应的工
4、作设想7中国预防与控制梅毒规划中国预防与控制梅毒规划（2010-20202010-2020年）年）梅毒实验室检测技术梅毒实验室检测技术梅毒实验室检测的意义梅毒实验室检测的意义n临床服务临床服务 筛查、确定现症梅毒患者；判断疗效。筛查、确定现症梅毒患者；判断疗效。n梅毒筛查梅毒筛查筛查梅毒感染者，尽早发现梅毒患者（筛查梅毒感染者，尽早发现梅毒患者（保证安全用血保证安全用血 预防经血传播病原体和抗体）预防经血传播病原体和抗体）n流行病学监测流行病学监测掌握梅毒流行趋势；了解不同高危人群的梅毒感染率掌握梅毒流行趋势；了解不同高危人群的梅毒感染率、发病率。、发病率。（MSMMSM、FSWFSW）概述概
5、述-梅毒病原体梅毒病原体小而纤细的螺旋状微生物小而纤细的螺旋状微生物长长5 520m20m，粗细，粗细0.2m22年），年），但妊娠时仍可传染给胎儿但妊娠时仍可传染给胎儿,病期越长，传染性病期越长，传染性越小越小;概述概述-梅毒的诊断梅毒的诊断梅毒的诊断必须依靠病史、症状及实验检查进行综梅毒的诊断必须依靠病史、症状及实验检查进行综合分析。合分析。梅毒的实验室检查结果对诊断有决定性意义。梅毒的实验室检查结果对诊断有决定性意义。常用梅毒实验室检测方法常用梅毒实验室检测方法n病原学检测病原学检测n血清学检测血清学检测病原学检查病原学检查n原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组
6、织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。n方法：病原学检查的主要方法有暗视显微镜检查、镀银染色法和直接荧光法病原学检查的临床意义病原学检查的临床意义n病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且具有快速、方便、易操作的特点。n螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。n如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性，16梅毒血清学检测方法梅毒血清学检测方法梅毒血清学检测分类梅毒血清学检测分类(1)(1)（非特异性梅（非
7、特异性梅毒抗体）毒抗体）(2)(2)（特异性梅毒抗（特异性梅毒抗体）两类方法。体）两类方法。非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理n梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对螺旋体表面的脂质作出免应答，在3周-4周产生抗类脂抗原的抗体（反应素）。抗体主要是IgM和IgG混合抗体。n未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转为阴性。问题问题2 2：临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么有：临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么有定性和定量两种检测方法定性和定量两种检测方法 非梅毒螺旋体抗原血清学原理非梅毒螺旋体抗原血清学原理n所有非梅毒螺旋体抗
8、原血清试验的抗原基本成分都是一样n方法包括：（1）快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)（2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）（3）性病研究实验室试验(VDRL)等。n基本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇n抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见n上述方法的敏感性和特异性都基本相似非梅毒螺旋体抗原血清学原理非梅毒螺旋体抗原血清学原理VDRLVDRL试验试验USRRPR/TRUSTVDRL试验n抗原组成：0.03%心磷脂n 0.21%卵磷脂n 0.90%胆固醇n抗原需新鲜配制 不能保存n待检血清需灭活n目前主要用于脑脊液检查n显微镜观测结果USR试验n是VDRL试验的改良n抗原组成：同
9、VDRL，另含 （1）乙二胺四醋酸(EDTA)使抗原可长期保存，能维持一年；（2）含有氯化胆碱 对血清能起到化学灭活的作用 不必加热灭活 （3）制成试剂盒 使用方便RPRRPR试验试验n在USR试剂成分的基础上 加入黑色碳颗粒 作为沉淀的指示物 n用白色的硬纸片替代玻片n血清不需要灭活n不需要显微镜观测结果n可作定量试验n有现成的试剂盒 携带方便n操作简单n价格便宜 非梅毒螺旋体抗原血清学原理非梅毒螺旋体抗原血清学原理TRUSTn其原理和成分与RPR试验相同n用红色的甲苯胺红替代了碳颗粒 n其余的特点均与RPR相同非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺
10、旋体抗原血清学试验操作要点非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1 1、仪器：水平旋转仪。仪器：水平旋转仪。2、定性试验n加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内n加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原n反应：将卡片置水平旋转仪旋转8分钟，立即在亮光下观察结果3、定量试验n稀释夜准备：在圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定稀释度），勿将盐水涂开。n加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。n 下同定性试验。RPRTRUSTVDRL非梅毒螺旋体抗原血清学试验结果判断非梅毒螺旋体抗原血清学试验结果判断滴度：出现凝集反应的血清最高稀释倍数。非
11、梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义n早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，VDRL试验抗体滴度下降2个稀释度，6个月下降4个稀释度。n 一期梅毒1年后转为阴性n 二期梅毒2年后转为阴性。n 晚期梅毒 治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义n非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。n早期梅毒硬下疳出现1周-2周后，血清可呈阳性。n经治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。非梅毒螺旋体抗原血清学
12、试验特点非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点n非梅毒患者的梅毒血清反应呈阳性，此现象称为梅毒血清反应假阳性。n 技术性假阳性反应 由于标本的保存不当（如细胞污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成。n 生物学假阳性反应 是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清试验出现阳性 非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点n梅毒假阳性反应的处理n技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可除外。n对急性生物学假阳性反应，应做TPHA（TPPA）等试验进行排除。非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点n前带现象 指非梅毒螺旋
13、体抗原血清试验中，有时血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性、不典型或阴性反应的结果，而临床上又象二期梅毒，此时将血清稀释后再进行试验，出现了阳性的结果，该现象称为前带现象。非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点耐血清性（血清固定）指经抗梅毒治疗后，非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不阴转。早期的耐血清性常与治疗量不足或不规则治疗、复发、再感染或有神经系统梅毒等因素有关。梅毒螺旋体抗原血清学试验原理梅毒螺旋体抗原血清学试验原理n梅毒螺旋体特异蛋为抗原，检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。n感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。问题问题3
14、 3：的定量试验在的定量试验在梅毒诊疗中有意义吗？梅毒诊疗中有意义吗？梅毒螺旋体抗原血清学试验方法梅毒螺旋体抗原血清学试验方法n梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)n 梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)n 梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）n 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)n 荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）n 化学发光免疫分析法（CLIA）n 梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）TPPA/TPHATPPA/TPHA TPPA试验原理与TPHA试验基本相同。TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒替代TPHA试验中致敏羊红细胞，此致敏颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，
15、具有较高的敏感性。明胶粒子为洋红色，在操作部步上也较为方便，出结果较快。+Sheep red cellT.pallidum+Sensitised cellSensitised cellSpecific AntibodyHemagglutinationTPPA(TPHA)TPPA(TPHA)试验原理示意图试验原理示意图TPPATPPA试验检测试验检测流程流程试验前期准备n微量振荡仪n试剂检查n25l移液器、吸头n记号笔、废物缸n有盖湿盒n工作服n一次性手套、口罩、帽子n生物安全柜TPPATPPA试验检测流程试验检测流程n使用前将试剂盒从冰箱中取出，室温放置30分钟。n在96孔U型板上编上相应的待
16、检样本的编号。n按标签标明量（0.6ml)向每瓶冻干致敏粒子（C液）和未致敏粒子（D液）各加入溶解用液（A液）复溶，置室温不得少于30分钟。TPPATPPA试验检测流程试验检测流程n每份标本做4孔，加标本稀释液（B液）至U型反应板，第1孔100l，第24孔各25 l。n用移液器取血清25 l至第1孔，反复混匀后取25 l至第2孔，连续倍比稀释至第4孔，最后1孔混匀后弃去25l。n第3孔加未致敏粒子D液25 l，第4孔加致敏粒子C液25 l n将微量反应板置震荡器震荡30秒。n置微量反应板于有盖湿盒内，37孵箱或室温（15-30）静置2小时后，观察结果。TPPATPPA试验检测流程试验检测流程结果报告:n观察加D液的第3孔，不出现凝集为有效试验。n阳性：第3孔不出现凝集，第4孔出现1+4+凝集反应。n阴性：第3、4孔均不产生凝集反应。FTA-ABSFTA-ABS试验试验 FTA-ABS试验是检测梅毒的“金标准”试验。其原理是将有完整形态的梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用Reiter螺旋体制备而成）吸收过的梅毒患者血清形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FTIC）标记的抗人免疫球蛋白，与
