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1、致病菌的检验致病菌的检验金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌的检验参考:GB 4789.10-2010目的目的 1、了解金黄色葡萄球菌的生物学特征级临床、了解金黄色葡萄球菌的生物学特征级临床症状。症状。2 2、了解食品中金黄色葡萄菌群在食品卫生检、了解食品中金黄色葡萄菌群在食品卫生检验中的意义。验中的意义。3 3、学习并掌握金黄色葡萄球菌群的检验方法、学习并掌握金黄色葡萄球菌群的检验方法。基本原理基本原理 肉汤中培养时菌体可生成血浆凝固酶肉汤中培养时菌体可生成血浆凝固酶并释放于培养基中，此酶类类似凝血酶原并释放于培养基中，此酶类类似凝血酶原物质，不直接作用
2、到血浆纤维蛋白原上，物质，不直接作用到血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂激活后而是被血浆中的致活剂激活后,变成耐热的变成耐热的凝血酶样物质凝血酶样物质,此物质可使血浆中的液态纤此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变成纤维蛋白维蛋白原变成纤维蛋白,血浆因而成凝固状血浆因而成凝固状态。态。金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶。在血金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶。在血平板上生成金黄色色素使菌落呈现金黄色；由于平板上生成金黄色色素使菌落呈现金黄色；由于产生溶血素使菌落周围形成大而透明的溶血圈，产生溶血素使菌落周围形成大而透明的溶血圈，金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，
3、使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血素，使数致病菌株能产生溶血素，使血琼脂平板菌落周血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些事。这些事鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。在鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。在B-P平板上平板上生长时，因将亚碲酸钾还原成碲酸钾使菌生长时，因将亚碲酸钾还原成碲酸钾使菌落落呈灰黑色呈灰黑色；因产生脂酶使菌落周围有一；因产生脂酶使菌落周围有一混浊带混浊带，而在其外层饮产生蛋白水解酶有一而在其外层饮产生蛋白水解酶有一透明带透明带。基本原理基本原理金黄色葡萄球菌定性检验金黄色葡萄球菌定性检验检验程序检验程序样品处理（由准备
4、组完成）样品处理（由准备组完成）选用选用液体液体样品样品-打开放置两天的牛奶打开放置两天的牛奶 吸取吸取 25 mL 25 mL 样品至盛有样品至盛有 225 mL 225 mL 7.5%7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤或或 10%10%氯化钠胰酪胨氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠数量的无菌玻璃珠 )中，振荡混匀。中，振荡混匀。注：本次使用注：本次使用7.5%7.5%氯化钠肉汤氯化钠肉汤增菌和分离培养增菌和分离培养 将上述样品匀液于将上述样品匀液于 36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h。金黄色葡萄球菌。金黄
5、色葡萄球菌在在 7.5%7.5%氯化钠肉汤中呈混氯化钠肉汤中呈混浊生浊生 长长，污染严重时在，污染严重时在 10%10%氯化钠胰酪胨大豆肉氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。汤内呈混浊生长。将上述培养物，将上述培养物，分别划线接种分别划线接种到到 Baird-Baird-Parker Parker 平板和血平板平板和血平板，血平板，血平板 36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h。Baird-Parker Baird-Parker 平板平板 36 36 1 1 培培养养 18 h18 h24 h 24 h 或或 45 h45 h48 h48 h。金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌
6、在在 Baird-Parker 平板上平板上，菌落直，菌落直径为径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色颜色呈灰色到黑色，边缘为边缘为 淡色淡色，周围周围为一为一混浊带混浊带，在其，在其外层外层有一有一透明圈透明圈。用接种针接。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇 到非脂肪到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌 落所产生的落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上在血平板
7、上，形，形成成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时金黄色（有时为白色）为白色），菌落周围可见，菌落周围可见完全透明溶血圈完全透明溶血圈。挑取上述。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固 酶试验。酶试验。B-P平板及血平板上金葡菌的生长状况平板及血平板上金葡菌的生长状况 A 染色镜检：染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5m1m。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等革兰氏染色法一般包括初染、媒染
8、、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。）涂片固定。2）草酸铵结晶紫染）草酸铵结晶紫染1分钟。分钟。3）用水冲洗。）用水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染约）加碘液覆盖涂面染约1分钟。分钟。5）水洗，用吸水纸吸去水分。）水洗，用吸水纸吸去水分。6）加）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒秒后水洗，吸去水分。后水洗，吸去水分。7）蕃红染色液染）蕃红染色液染2分钟后，用水冲洗。干燥，镜分钟后，用水冲洗。干燥，镜检。检。鉴定鉴定B B 血浆凝固酶试验：挑取、血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker Baird-Parker
9、平板或平板或血平板上可疑菌落血平板上可疑菌落 1 1 个或以上，分别接种到个或以上，分别接种到 5 mL 5 mL BHI BHI（2 2个个B-PB-P平板平板 2 2个血平板个血平板 1 1个阳性），个阳性），36 36 1 1 培养培养 18 h18 h24 h24 h。取兔血浆取兔血浆 ，加入，加入 BHI BHI 培养物培养物 0.2 mL0.2 mL0.3 mL0.3 mL，振荡摇匀，置振荡摇匀，置 36 36 1 1 温箱或水浴箱内，每半温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察小时观察一次，观察 2 2次，如次，如呈现凝固呈现凝固（即将试管（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝倾斜或倒置时
10、，呈现凝 块）或块）或凝固体积大于原体积凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌验阳性和阴性葡萄球菌菌 株的肉汤培养物作为对照。株的肉汤培养物作为对照。鉴定鉴定结果与报告结果与报告 结果判定：在血平板结果判定：在血平板、B-PB-P平板的平板的菌落特征、镜检结果符合金黄色葡萄菌落特征、镜检结果符合金黄色葡萄球菌的特征，及血浆凝固酶试验阳性球菌的特征，及血浆凝固酶试验阳性的，可判为金黄色葡萄球菌阳性。的，可判为金黄色葡萄球菌阳性。结果报告：在结果报告：在 25 g（mL）样品中）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。检出或未检出金黄色葡萄球菌。
