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1、人类淋巴细胞株培育本科学生综合性试验报告学号姓名学院生命科学学院专业、班级试验课程名称细胞生物学试验老师及职称倪娟（助理试验师）开课学期2011至2012学年上学期填报时间2011年12月1日云南师范高校教务处编印一.试验设计方案试验序号试验四试验名称人类淋巴细胞株培育试验时间2011.11.311.24试验室生物综合试验室21.试验目的（1能独立地进行用于细胞培育的个中器皿的清洗与消毒，驾驭干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的运用方法。（2）娴熟驾驭RPMI1640培育基的配制方法。（3）娴熟驾驭细胞传代培育的操作方法。（4）视察外培细胞在不同时期的形态改变及生长状况。
2、（5）驾驭死活细胞的鉴别原理及方法。2.试验原理、试验流程或装置示意图试验原理：（D传代培育是组织培育常规保种方法之一。也是几乎全部细胞生物学试验的基础。当细胞在培育瓶中长满后就须要将其稀释分种成多瓶，细胞才能接着生长。这一过程就叫传代。传代培育可获得大量细胞供试验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都须要细致细致的无菌操作（2）清洗与消毒是组织培育试验的第一步，是组织培育中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培育细胞所运用的各种玻璃或理料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培育不好与清洗不彻底有很大关系。（3）灭菌手段的选择也非常重要，对不同的物品需采纳不同的灭菌方法。假如选用的方法
3、不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丢失了养分价值、生物学特性或其他运用价值也不行。（4）细胞培育运用的培育基一般是由合成培育基和小牛血清配制而成。合成培育基有商品出售，它是依据细胞生长的须要按肯定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化令物、无机离子和其他协助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相像。小牛血清含有肯定的养分成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子：醯、微量元素和激素：爱护作用；供应伸展和贴附因子等，是合成培育基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质（重金屈、抗菌素）的毒性。（5）冗基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸
4、细胞自身不能合成，必需依靠培育基供应，这几种氨基酸称为必需双基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷完酹胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培育液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷城酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20C冰箱中保存，在运用前加入培育液内。（6）悬浮型细胞培育常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓痛细胞和腹水型恶性细胞等的培育。悬浮型细胞传代培育的最大特点是原代细胞不必经过机械分别或消化酶消化处理，传代时只须把培育的悬浮细胞做适度稀释或把培育细胞经简洁的离心处理后再加入适量的培育液即可培育。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭遇的机械损伤和化学损伤的可能性较少，
5、损伤程度也较轻，相对而言，传代的胜利率较高。但由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培育基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培育或传代培育的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个改变阶段，其培育的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大。（7）细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色解除法。由于很多酸性物质不易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区分死活细胞。3.试验设备及材料（一）仪器：超净工作台、干燥箱、过滤器、高压灭菌锅、多重蒸储水器、磁力搅拌器、天平、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、
6、超低温冰箱、二氧化碳培育箱、显微镜、血球计数板（二）材料：微孔滤膜（直径25rnm,孔径为O.22um）、细胞培育瓶、玻璃棒、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、pH试纸、微孔过滤器（0.22m）及注射器、各种规格的Tip、离心管、细胞培育瓶、滴管、人类淋巴细胞株（三）试剂：75%酒精、重辂酸钾、浓硫酸、NaOHxHe1、1%酚红、RPMI1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素、饱和NaHC03、1.-谷氨酰胺、三蒸水、乙醇、0.4%台盼蓝溶液（生理盐水配制）试验流程：一、细胞培育打算工作：（1）洗液的配置：重格酸钾6.3g加蒸馀水20m1.加热充分溶解后冷却再加入浓硫酸100m1.充分溶解再倒入洗
7、液缸（2）玻璃器皿清洗干燥酸性洗液浸泡过夜清洗干燥包装消毒灭菌备用（3）胶塞清洗干燥包装消毒灭菌备用二、培育基的配制：配置RPMI1640培育液加酚红通入C02超净台中过滤除菌按肯定比例加小牛血清、谷氨酰胺和双抗溶液三、细胞传代培育：超净工作台中取8m1.生长培育基到H己的细胞培育瓶中接种适量细胞悬液旋上盖子放入二氧化碳培育箱中平放并旋松瓶盖四、死活细胞的鉴别：倒置显微镜下视察将细胞团吹散取肯定量的细胞悬液到离心管中加入等体积台盼蓝染液混合并放置Imin用血球计数板在显微镜下进行死活细胞的计数计算每亳升原液细胞数以及细胞存活率4.试验方法步骤及留意事项试验步骤：一、打算工作：（一）清洗：1 .
8、新玻璃器皿的清洗：先用H来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。2 .运用过的玻璃器皿的清洗：（1）马上进入清水，避开干枯难洗；（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥：（3）浸酸性洗液过夜；（4）从洗液捞出自来水冲洗1015次去除酸性洗液,蒸储水刷洗10次，倒置烘干：（5）包装（牛皮纸或不透水纸）：（6）高压（15磅20min）或干热（160度2h）灭菌；备用。胶塞处理：（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用O.2%Na0H煮沸1020mino（2）自来水清洗10次（3）用隔稀盐酸浸泡30mi11o（4）自来水清洗10次，蒸储水刷洗10次。晾干（5）旧胶塞不必
9、用酸碱处理可干脆用洗涤剂煮沸清洗数次，过蒸镭水，晾干，包装高压灭菌，即可运用。三）塑料制品的清洗：（1）用洗涤剂清洗，H来水冲洗数遍（2）强（次强）酸洗液浸泡26h.（3）自来水冲洗10次以上，蒸储水刷洗10次（4）浸泡在70%乙醇0.51.h,备用。（5）用前从乙醉中取出，在超级工作台内紫外线照耀1.h。（四）洗液的配置：（1）将重铭酸钾放入大烧杯中，加入蒸储水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铭酸钾充分溶解。（2）将重辂酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。（五）湿热灭菌也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、盥料以及
10、加热后不发生沉淀的无机溶液。二、培育基的配置：（一）RPMI1640培育液配制：配制50m1.RPMI1640培育液:称取RPMI1640干粉0.52g,溶于50m1.的三蒸水加入转子,置于磁力搅拌器上搅拌20min,直到液体变为澄清为止。(二)RPMI1640合成培育基配制：(1)加入0.Im1.1%的酚红，通入C02,使液体变为金黄色，说明培育基完全溶好。(2)溶好以后的培育液在超净台中进行0.22m滤过除菌，分装至细胞培育瓶中。3 3)RPM1.1640生长培育基的配制：所需各组分如下表所示之后再用饱和NaHCO3调整pH至6.8-8.0(酚红在低PH值时呈现黄色,在高pH值时呈现红色,
11、但在pI6.6至8.0间会呈现橙色)。三、细胞传代培育：超净工作台中操作每小组用一个培育瓶配制40m1.的生长培育基每人取8m1.培育基到自己的细胞培育瓶内向细胞培育腋内接种700-850u1.的人淋巴细胞株原液细胞悬浮液放入二氧化碳培育箱，旋松瓶盖(依据细胞的数量看细胞培育瓶是否平放或宜立放置)隔两三天后视察细胞生长状况。四、死活细胞鉴别：(1)取20U1.细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合,放置Imin0(2)取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充溢计数板和盖片之间。（3）低倍镜下视察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已
12、死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。（4）计算每电升原液细胞数以及细胞存活率。留意事项：（1）在配置强洗液时操作时留意平安，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应马上用大量清水冲洗。（2）运用移液枪时要留意往下按时按的程度，规范操作。（3）整个试验过程中都要留意精确的称量物体和所需的溶液。传代培育时要留意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。全部操作要尽量靠近酒精灯火焰。（4）接种时肯定要将细胞吹散，使细胞悬液尽可能的匀称。（5）往血球计数板滴液留意不要有气泡，也不能滴太多，否则会使靛片浮起而使细
13、胞计数不准。6）留意血球计数板在显微镜上的操作，留意光圈和亮度的调整，以便能更好的找到格子，进行细胞计数。（7）进行计数时要清晰的区分死活细胞，留意不要将细胞数重了数多了，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。还要应进行多次计算，取平均值。（8）留意区分染料颗粒和死细胞。40电升储备液浓度终浓度RPMI1640培育液35.5谷城酰胺0.430mgm1.0.3mgm1.双抗0.04100000um1.100um1.小牛血清410%5.试验数据处理方法计算经过传代培育的人体淋巴细胞的细胞悬液中所含的细胞数量一般以细胞数/冬升表示。计算：每个大方格边长为1mm,则每个大方格面积为IX1.=Im
14、in2。盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1X1X1=0.1mm3,Im1.=1000mm3每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400=1.4000mm3=1/4000,OOOrn1.每毫升原液细胞数=4大格细胞总数/410000稀释倍数细胞存活率（）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数6.参考文献马丹炜，王万军.2010.细胞生物学试验教程.北京：科学出版社安利国.2004.细胞生物学试验教程.北京：科学出版社翟中和，王喜忠，丁明孝.2007.细胞生物学.北京：高等教化出版社二.试验报告1.试验现象与结果（一）经过3天的培育之后，细胞培
15、育液的颜色改变不大，是透亮略黄的，可隐隐看到细小圆形白色颗粒悬浮在培育液中，即为细胞团。（二）培育一周后，将培育瓶取出，可看到培育液还越澄清透亮，淡黄色。将培育瓶苴于倒置显微镜上视察，可看到细胞颗粒的浮动。（三）显微镜下用血球计数板计数，活细胞较透亮，死细胞被染色，留意与染料颗粒区分。将计数结果记入下表内大格子细胞数第一个其次个第三个第四个合计活细胞A1278936B1076932平均1177934死细胞A614213B414211平均514212每个大方格边长为1mm,则每个大方格面积为IXI=Imm2。盖上盖玻片后，载玻片与盖破片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为0.1X1X1=0.1mm3,Im1.=1000mm3。每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为0.1/400=1/400OmnI3=1/4000,OOOm1.依据表内数据计算:每室升原液细胞数=4大格细胞总数/410000稀释倍数=464100002=230,000（个为1）细胞存活率（%）=（细胞总数一死细胞数）/细胞总数=3446100%=73.91%2.对试验现象、试验结果的分析及其结论（1）经过培育后，培育液颜色由淡红变黄
