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1、小白鼠卵母细胞体外成熟培育环境优化筛选哺乳动物体外受精探讨已有一百余年的历史。早在1878年,澳大利亚科学家Schek就用兔进行过试验。1935年，Pincus和Enzmin首次视察到离开卵泡的兔卵母细胞可在没有促性腺激素的培育条件下自动复原和完成减数分裂【1】。自从他们发觉有腔卵泡中的卵母细胞在体外培育可以自发成熟这一事实以来，人们在卵母细胞体外成熟方面做了大量的工作，已胜利地使多种哺乳动物的卵母细胞在体外成熟、受精以及受精卵在体外接着发育。1959年张明觉胜利使兔卵母细胞体外受精并产仔，获得世界首例的“试管动物”试管兔。1965年,EdWardS通过探讨小鼠、绵羊、牛、猪、舜猴和人的卵母细
2、胞体外成熟，发觉卵母细胞离开卵泡环境后的自发核成熟是哺乳动物的普遍现象。1968年,Wittingham获得体外受精“试管小鼠”，1982年，EPPing等对小鼠腔前卵泡进行了体外成熟和体外受精探讨，并胜利产仔。国内，陈秀兰等于1986年胜利获得“试管小鼠”。关于人的卵母细胞体外受精的探讨，EChWardS等在1969年就有过报道。通过儿十年的不懈努力，卵母细胞的成熟系统已日趋完善，先后有30多种哺乳动物的体外受精后代诞生。在体外受精技术不断发展的过程中，卵母细胞的体外成熟始终被探讨者所关注，卵母细胞在体外成熟的好坏干脆会影响受精以及早期胚胎的发育。因此,国内外学者对卵母细胞的体外成熟培育系统
3、进行了大量而卓有成效的探讨。总之，卵母细胞体外成熟培育系统的建汇是根据仿生学的思路，如模拟卵巢液的成分和卵巢环境而逐步完善起来的，使体外培育环境与母体体内相像，使体外培育的卵母细胞与体内成熟的卵母细胞相同。最初运用的卵母细胞成熟培育基础液有Tyrode、Gey、Ear1.e、Hanks等盐类缓冲液，近年来多应用合成培育液如M1.99、HamsF1.O和HamsF12,而以M199应用最广泛。大量探讨表明，以TCMI99为卵母细胞体外成熟的基础培育液，对牛、绵羊和猪的卵母细胞进行体外成熟培育，成熟率可达80%以上。在基础培育液中添加其它成分可提高卵母细胞的体外成熟率。不同探讨者目前常添加成分也不
4、同。一般都加HCG、PMSG、FSH.1.H、Ez等。促性腺激素能诱发卵丘细胞扩展、增加达到MII期的成熟率，并有促进卵裂的作用；FSH可以抑制颗粒细胞凋亡,维持颗粒细胞的成活力,进而维持颗粒细胞和卵母细胞间的联系；能够刺激卵丘细胞扩散,而扩散的卵丘细胞能够分泌种粘性的透亮质酸,它有助于提高精子的活力。FSH.EGF可以促进牛腔前卵泡颗粒细胞的增生和卵泡存活,并使卵泡具备类固鸣激素合成实力。添加雌激素对卵母细胞体外成熟的影响，尚存在分歧。多数学者认为雌二醉对卵母细胞完全成熟是有帮助的，雌二辞是促进胞质成熟的重要成分,它能促进卵母细胞成熟分裂的复始,乂能显著提高卵母细胞的受精实力及早期胚胎的发育
5、实力。可显著提高受精后胚胎的发育率。但在添加发情牛血清、发情山羊血清时，雌二醉对卵母细胞体外成熟和胚胎发育并不重要。以添加发情牛血清取代促性腺激素和雌激素，同样可使牛卵母细胞成熟率达90%以上，因而主见无激素培育法,并也得到了较好的试验结果。所得结论差异的缘由可能是由于成熟培育液中添加了未知大分子物质和激素,从而掩盖、抑制或变更了Ez的作用。很多探讨证明在牛的卵母细胞成熟培育液中添加1.H（志向浓度50ugm1.）可使卵丘细胞利用葡萄糖生产丙酮酸的活性增加，促进三度酸循环产生更多的ATP,进而提高卵子的成熟度和受精后的发育潜力。Chian指出,在不含促性腺激素的成熟培育液中进行成熟培育,卵丘细
6、胞的有无对卵母细胞后来的激活率无明显影响；但假如在成熟培育液中加入促卵泡素(FSH),则卵丘细胞的存在显著抑制了卵母细胞激活实力的获得。这证明白卵丘细胞的作用受激素的调控。然而，更多的探讨者都在成熟液中添加血清白蛋白。血清白蛋白是血清中的大分子物质，具有很强的结合胆固醇和锌离子的实力，可除去精子质膜中的部分胆固爵和锌离子，降低胆固静在精子质膜中的比例，进而变更精子质膜的稳定性，导致精子的获能。此外，BSA还可使获能精子快速穿透卵子，对受精具有促进作用。探讨表明，BSA与丙酮酸钠和乳酸钠同时应用可使鼠卵受精率高达83-95%9。血清口蛋白中应用最广泛的是牛血清白蛋白（BSA）,由于BSA的作用时
7、间较长，且诱发精子获能的实力不强，故常作为协助成分，但它对于卵母细胞前期的培育也有一些影响，也有人通过添加牛血清白蛋白（BSA）来提高卵母细胞体外成熟、受精和早期胚胎发育率.所以BSA广泛地应用培育液中没有或不足的养分以及必需的生长调整因子，从而促进卵丘细胞层扩散和卵母细胞发育成熟。还能中和毒性物质爱护细胞不受损害；对培育液的PH有缓冲作用【刈。卵母细胞成熟培育所用血清般为牛血清，常用的血清有胎牛血清(FCS)、发情牛血清(OCS)和阉公牛血清(SS).Younis(1989)和Sche1.1.ander(1990)探讨证明OCS比FCS效果好,添加浓度10%为宜。目前，牛、羊卵母细胞成熟培育
8、大都在M199+10%ECS+FSH+1.H+E2中培育，的具有生理学意义的评价11。因而现在用于体外受精的主要是卵丘细胞扩散的、并排出第一极体的卵母细胞。因此，动物卵母细胞在体外进行成熟培育要受到多种因素的影响。诸如动物种类异同、卵母细胞不同类型、获得卵母细胞的卵泡大小、成熟培育时间、培育温度、培育液、生长因子、激素等。即使卵母细胞在相同的培育体系中培育,其成熟率也会存在差异。为了优化小鼠卵巢卵母细胞体外成熟培育液，提高卵母细胞体外培育的成熟率：也为了致。3.2 培育液添加成分对小鼠卵母细胞体外成熟的影响丙酮酸钠作为种胚胎早期发育的主要能量代谢底物，它对卵母细胞的成熟起到举足轻重的作用，我们
9、在试验中发觉添加丙的酸钠能显著促进卵母细胞的成熟发育，从表4存，添加丙酮酸钠后卵母细胞的成熟率由12.3%提高到23.8%。而用mDPBS+丙酮酸钠+BSA或mDPBS+丙酮酸钠+FCS组成的培育液来培育卵母细胞,它的成熟效果乂高于mDPBS+丙酮酸钠组成的培育液，这表明BSA和FCS对卵母细胞的成熟又有促进作用。很多探讨者在卵母细胞成熟培育液中添加BSA和FCS来提高卵母细胞的体外成熟率,据认为BSA和FCS对卵母细胞的早期发育有好处，尤其添加FCS后，其效果不仅明显优于不添加蛋白组，而且明显优于添加BSA.与本试验结果相像，李朝军等在进行体外受精探讨时发觉，在含血清的培育液中成熟卵母细胞的
10、，其体外受精率要高于在含BSA的培育液中成熟的卵母细胞112】。与BSA相比，血清除含有BSA外，还含有很多对细胞生长发育有益的物质如生长因子、激素、维生素、抗氧化物等。3.3 卵子类型对卵母细胞成熟发育的影响Eppig等报道，裸卵的GVBD和PBI的发生率要高于A、B级卵的GVBD和PBI的发生率。与Eppig等的报道相像,本试验裸卵的GVBD发生率（100.0%）也明显高于复合卵母细胞（A级86.5%,B级76.0%）,PBI的排出率也明显较高（C级86.2%,A、B级分别为65.6%和36.0%）。而且与大多数探讨相像，发觉裸卵的GVBD和排出PBI的时间较早。探讨表明卵母细胞四周的颗粒
11、细胞能分泌卵母细胞成熟抑制因子（OMI）,抑制卵母细胞的自发成熟在培育操作过程中，由于机械性作用致使颗粒细胞脱落，从而解除了对卵母细胞成熟的抑制，使卵母细胞的成熟机制启动【】的，从而大大的提高了裸卵的成熟率。而在A、B级卵中，由于卵丘细胞较多，卵母细胞与四周的卵丘细胞和颗粒细胞的联系紧密，培育操作时不能使颗粒细胞脱落，颗粒细胞分泌的卵母细胞成熟抑制因子的作用不能解除，所以A、B级卵母细胞在体外成熟培育过程中成熟的少，成熟的速度慢。参考文献1 VanderhydenBCzArmstrongDTRoIeofcum1.usce1.1.sandserumontheinvitromaturationzf
12、erti1.izationandsubsequentofratoocytesJ.Bio1.Reprod,1989,40：720-728.2 SchroederAC.EppingJJ.Thedeve1.opmenta1.capacityofmouseoocytesthatmaturedspontaneous1.yinvitroisnorma1.J.DevBio1.,1984,10(2):493-497.3 WhittinghamD-G.Ferti1.1.izationofmousegeesinvitroJ.Nature.1968,200：592-5934 EppingJJandACShroede
13、nCapacityofmouseoocytesfrompreantra1.fo1.1.ic1.estoundergoembryogenesisanddeve1.opmentto1.iveyoungaftergrowthzmaturationandferti1.izationinvitroJ.Bio1.Reprod.1989,5(41):268-276.尹海林,陈秀兰.遗传限制M.遗传,1987,6(3):18-19.6刘红林,范必勤.晡乳动物卵母细胞的体外成熟成.畜牧与兽医,1996,2(4):180-183.7ChinaRCzSirorrdMA,Effectsofcumu1.usce1.1.
14、sandhornonesduringinvitromaturationontheparthenogeneticactivationofbovineoocyteJTheriogeno1.ogyz1994z5(41):186.8刘红林,范必勤,汪河海等.体内外成熟与老化对小鼠卵激活刺激敏感性的影响J.江苏农业报,1998,14(1):42-44.9Pa1.omoMJzMogas,Teta1.EffectofheparinandspermconcentrationonIVFofprepuberta1.goatOocytesJ.Theriogeno1.ogyz1995,43(5):292.10陈俊颖，魏泓等,山羊体外受精的探讨J.中国试验动物学报,2004,12(1):35-38.11钱云,师蔚群,丁家桐.哺乳动物体外受精探讨进展J.动物科学与动物医学,2000,17(1)：26-28.12李朝军,王斌等.小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培育、体外成熟和体外受精的探讨J.南京高校学报(自然科学),1997,33:265-269.13彭进摘.晡乳动物卵母细胞的体外成熟探讨J.国外畜牧科技,1985,6(5):34.14乌日琴,陈系古等.小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精的效果视察J.中国试验动物学报,1999,12(2):81-84.
