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1、疮端斑部位m橘木栓层形成的细胞学和E1.sinoewrG制的生长抑制摘要：对E1.sinoe命陷双打侵染的柑橘(无核蜜橘)果实和叶片上的寄住-寄生物互作关系的超微结构方面进行研究.其菌侵染导致寄寄住住组织在侵染部位的下面临近坏死区域形成木栓层.这些木栓层由致密的寄住细胞组成，这些细胞具有豆杂的细胞生和交替薄状层，表明在伤口周皮形成了木质组织。在木栓层下面寄住组织未被菌丝侵染.在细胞内和细胞外生长的俊熙，经常引起寄住细胞的过度生长和分离.另外，临近侵染菌丝的寄住细胞积累了高电子密度物质并在细胞间隙形成寄住细胞壁突起.菌丝和同轴体周围围绕着高电子密度层，在他们的表面具有发射荧光的结构，同轴体显示出
2、电子透明核.在细胞内或细胞外的菌丝细胞质内发现了一个或更多的内生茵丝.这些结果表明柑橘创伤周皮上的木质化软木层作为一种保护屏障，限制疮痂病斑边缘的病原菌生长.认为真菌形成同轴体和内生菌丝intrahyphahyphae,作为一种生存机制应对ZK和管养不足的环境，这种环境发生在坏死的寄主木栓尾部位.引言柑橘疮痂病是最函要的病吉之一,对水果市场来说降低了外观品质.该病吉导致果实斑点和叶片脓包(溃疡)无核小蜜橘(蜜柑)，占韩国济州岛26000ha柑橘种植面积的95%,易感染柑橘疮痴病,该病害由子囊菌E1.sinoefawcettii(无性Sphace1.omafawcettii)引起，该病菌是绝大多
3、数的热带,亚热带和温带地区的许多草本或木本植物上的病原菌.(SiVaneSanandCritchett,1969).该病害和病原的在生态学，病因学和分类学上被广泛研究(HyUneta1.,2001;Jenkins,1931;Whiteside,1975),然而在组织或细胞学上研究有限。认为E1.sinoespp.的侵染过程妖媚是通过自然孔口进入，包括上表皮细胞的间隙(MasOnandBackus,1969),或者通过粉碎或包夔上表皮(MaSonandWi1.son,1978).E1.sinoespp菌丝主要在细胞间侵染寄主组织，引起大量寄主细胞分割，细胞壁增厚和寄住组织中软木脂和类木质素物质积
4、累.(Gabe1.andTiffany,1987;MasonandBackus,1969;Wi1.1.iamsonandMcNicoI,1989).然而，E.fawcetti茵丝侵染柑橘的超微结构细节和细胞学过程尚未报道。通过这个侵染过程使得E1.sinoeSPP生长受限导致一定的局部病斑,如寄主植物上的危施和Si点，通过光学显微镜观察E.fawcettii侵染的柑橘叶片显示软木脂(木栓犀)和木栓形成层使得被病原菌侵染的部位分离，引起侵染叶片膨胀和穿孔(CUnningham,1928).认为有效的柑橘果实通过机械方式形成创伤周皮(Ornecrophy1.actic)应对浅表伤害，如昆虫和病原真
5、菌(AChoreta1.,1991;Whiteside,1988).在水果生长的后期阶段，创伤周皮产生少了，但果实通过在临近死亡组织处形成木质化的细胞屏障，可幸免于表皮损伤。创伤周皮WoUndPeriderm形成是对不利的环境刺激的非特异性反应，如创饬，昆虫损饬和病原药侵染(Ko1.attukudy,1984;Simardeta1.,2001).为了进一步认识柑橘柢抗病原菌侵染的结构变化的性质，和病原菌在病斑上的存活机制，有必要在超微结构水平上研究寄住-寄生物的互作关系.本研究旨在观察Efawcettii侵染柑橘后的超优观结构特性和研究在疮痂产生的过程中木栓层形成对病原菌生长的影响.材料与方法
6、接种体制备EJawcetHi分离自自然发病具有典型疮痂病斑的叶片上，叶片采自韩国济州岛密柑.感病叶片用75%酒精和1%的次速酸钠各消毒1min,并用无菌水冲洗干净。隙干后，y用手术刀将每个疮疵病斑切下，将有病组织碎片苣于ha1.f-strength的PDA培养基上，27培养.在IS行致病性测定后(HyUneta1.,21),选取一个典型的分离菌株培养2周，用于制备接种体，用小刀将小块的菌丝体(5-10mm3)在培养皿中切碎。获得的碎块加入液体Fries培养基(WhiteSide,1975).培养皿放在27培养2天，用无菌水冲洗三次，用0.05%的无菌吐温20淹没，并且在27C黑暗中过夜.用两层
7、纱布过谑得到无色透明分生抱子菌悬液，调至1.OX106个/m1.制备感病果实和叶片自然发病的具有典型疮痂症状的蜜柑果实采自韩国济州岛,在落花后一月采集.采集的病样用于研究疮痂病斑的亚细胞结构.将蜜柑的种子在温室中1833C下栽培，用于叶片接种.对植株进行修剪，使其新叶片萌芽一致，当叶片张到成熟叶片的四分之一的时候用抱子悬浮液接种。接种后理科用塑料袋保湿2天，以保持侵染的饱和湿度.3天后源?发病发病情况.透射电子显微康用无菌的刀片在果实和叶片的疮痂病斑部位切下方形组织块(每块2X2mm?下面组织Irnm厚).未经接种处理的果实和叶片的健康部位取样作为对照.样品用模式KarnovskyzS固定液(
8、KamOVsky,1965)包含2%(WV)戊二醛，2%(vv)多聚甲薮在0.05M二甲肿酸钠缓冲溶液中(PH7.2),4。C过夜，并用相同的缓冲液冲洗三次，每次IOmin.样匣用1%(wv)四氧化俄在相同缓冲液中4。C处理2h,并用2倍熬僧水迅速清洗.后携样品用0.5%错酸双氧铀着色，4下过夜。样品在一系列梯度的宜春中干煤，(30%,50%,70%,80%,95%,100%),然后在100%乙醵中处理三次，每次IOmin.样品进一步用氧化丙烯作为过度液处理两次,每次30min,并液入SPUKS的介质中.通过使用显微镜用薄片切片机，用金刚石刀片切成薄片(MT-X;RMCInCTucson,US
9、A).薄片(七Onm厚)嵌入镀铜网格，用2%的乙酸双氧铀和Reyno1.ds,柠檬酸铅若色(ReynoIds,1963)各7min.在80kV的加速电压下用投射电子显微镜检视(JEM-1010;JEO1.1.td.,TOkyO,J叩an).结果健康果实的投射电子显微显示表皮细胞覆盖了一层角质层病具有正常的细胞器，如细胞核，线粒体和液泡(FigUre1.a).健康叶片的近轴表面有一个角质屣而且未显示胞痍退化(Figure1.b),疮痂脓包最初在水果和叶片的表面形成.在侵染后期形成橙红色或微红的EJawcettii子实体。被侵染的叶片的近轴表面轻微突起，背面出现相应的凹陷.E.fawcettii侵
10、染果实的细胞病理学感病过是的表皮细胞脱落，在病斑上基靠出粗糙或木质表面(FigUre2a).在病斑的外表面有明显的几层萎缩的寄住细胞,木质层包括几乎没有细胞内含物的寄住细胞和木栓层的内部区域一最外层的下面几层由含有极少细胞间隙的致密的寄住细胞组成(Figure2b).这些寄住细胞拥有豆杂的细胞壁，具有光暗交替的薄层。EJawcettii的菌丝主要在感病果实的木栓层的细胞间生长；然而，在木栓层下面没有寄主组织被菌丝侵染(数据未显示).有的菌丝嵌入到寄主细胞壁中,并且wa1.1.apposition在寄住细胞内局部积累与黄丝侵染有关系(FigUre2c).菌丝细胞质里具有明显的;由球，液泡和同岫体
11、.同岫体，直径100-200nm,多成簇分布在三i丝细胞质病由几个单独的腹组成.(Figure2d).大多数同轴体具有电子透明核(e1.ectron-transparentcore),围绕着电子致密层，偶尔周围有光晕.同轴体表面覆盖细丝结构，尽管同轴体偶尔与细胞核有关系，不能确定有固定的位宜或空I整构.菌丝渗透到木栓层中的寄主细胞里，并且侵染的寄住细胞高度的形成空泡且异常增大，与临近的寄住细胞比显示出肥大(FigUre3a).另外,经常发生区分，表明寄主细胞进一步被细胞壁分离,这些细胞嬖通常成薄层，并且比其它的薄(FigUre3b).据大多数的细胞分裂与果实表面成自角(背斜的)，但偶尔薄细胞壁
12、处于不同角度.一个或多个内生菌丝经常分布在细胞内茵丝(FigUre3c).电子透明茵丝细胞壁清晰的将内生菌丝与封闭菌丝的细胞质分离开，并且嵌外面闭合菌丝偶尔在细胞质中出现一种薄片结构.有些感病的寄主细胞表现出细胞服从细胞壁上分商，在寄主细胞与菌丝紧上沉积了密联系的部位(FigUre3d).损坏的寄主细胞几乎缺少细胞内含物。并且细高电子密度物质.E.fawcettii侵染柑橘叶片的细胞病理学菌丝形在叶片的近轴表面形成了致密的下表皮子座，有的菌丝生长了Subcuticu1.ar1.y?(Figure4a).在扎兰叶肉组织中的表皮和亚表皮细胞组织广泛的被菌丝侵染.被侵染的细胞与未感病的果实细胞比，明
13、显扭曲.(Figure1.b).真菌渗透寄住细胞包括局部溶解寄主细胞壁，表现出临近菌丝的寄住细胞壁纤维模型fibri1.1.armatrix的改变(FigIJre4b).侵入的菌丝有电子透明e1.ectron-transparent细胞壁、细胞核、线粒体和同轴体.在叶片的栅栏叶肉组织的的细胞间隙经常可以观察到病菌侵染.真菌侵染经常伴随着临近侵染菌丝的寄住细胞中高电子密度物质的积累.特别是，在寄主细胞的中心液泡里，发现了高电子密度的斑点状集合体.寄住细胞壁与侵染菌丝经常在菌丝周围表现出各种纤维质地的高密度电子(FigUre4d),高电子密度的多密度物质局部枳累在贴近菌丝的寄主细胞壁周围。有坏死细
14、胞质的感病的寄主细胞显示细胞膜从临近侵染菌丝的细胞壁分潮(FigUre5a).在寄住细胞中出现了一些菌丝并出现完整的菌丝细胞质(FigUre5b).寄主细胞恶化严里.使得细胸内菌丝周围细胞器难识别.临近侵染菌丝的寄主细胞壁外偶尔形成细胞壁突起。在栅栏组织的细胞间隙，一些菌丝被各种形状和大小的细胞壁突起包围。细胞间菌丝的纵切片显示，在细胞质内它们有一个或更多的内生为丝intrahypha1.(Figure5d).虽然封闭的菌丝endosinghypha表现出退化的细胞质，它的内生菌丝具有完整的细胞质，有明显的细胞器和内含物。结论与讨论本研究表明柑橘对抗E.fawcettii侵染是木栓层形成的超微
15、结构联痂行程中真菌的表皮渗透反应.在侵染部位的下面临近坏死区域，真菌侵染诱导柑橘果实形成木栓层.这样的感病组织的结构变化是一种典型的创伤周皮形成的迹象(Aehoreta1.,1991;Simardeta1.,2001),尽管其他的创伤周皮组分,如木栓厨口软木层，不存在。很可能在具有软木脂的感病的柑橘果实上细胞壁具有交替薄展,因为栓化的细胞壁有的醛树脂的细小交替萌层和蜡状物组成，它们各自会出现高密度电子e1.ectron-dense和透明电子e1.ectron-trans1.ucent(Ko1.attukudy,1984).因此，在创伤周皮的木栓组织对病原菌是一种物理障碍.组织病原菌有毒物质的传
16、播，阻止非原质体水和营养物质从健康组织转移到侵染的部位,最后剥夺了病原菌的水和营养.(Achoreta1.,1991;Agrios,1997;Simardeta1.,2001)结果表明，木栓层限制了真菌侵染，也提供木栓层作为E.favveettii侵染的保护屏障,正如其它有关创伤周皮形成的研究报道(AChoreta1.,1991;Simardeta1.,2001).考虑到先前研究中疮痂病菌侵染的柑橘叶片木栓层和木栓形成层的形成(CUnningham,1928),认为创伤周皮形成在柑橘疮痂病斑的形成，通过向外推动坏死组织和完全将病原菌从寄主侵染部位移除(Agrios,1997).然而，柑橘果实中感病的木栓层中寄主细胞，认为是未栓化井提供水和营养的通道。其它的寄住细胞变化与克菌侵染有关，包括寄住细胞中高电子密度物质积累.基于它们的纹理和电子密度,这些物质可瞅口酚类TNSca1.eteta1.,1989),附有壁在寄主细胞内形成，与齿丝有关
