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1、ICSB 点击此处添加CCS号B22吉 林 省 地 方 标 准DB 22/T XXXX-XXXX华支睾吸虫卵检测方法PCR和实时荧光PCR法Detection methods of Clonorchis sinensis metacercaria eggs: PCR and real timePCR（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。XXXX -XX-XX 发布XXXX -XX-XX 实施吉林省市场监督管理厅发布本文件按照GB/T 1. 1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本部分由长春海关提出并归口。本部分起草单
2、位：长春海关。本部分主要起草人：马文晨、孟庆峰、王准、王玮琳、刘金华、孟日增、王伟利。华支睾吸虫卵检测方法1范围本标准规定了人粪便中华支睾吸虫卵检测方法的原理、试验条件、试剂与材料、仪器设备、样品、 试验步骤和试验数据处理及试验报告。本标准适用于人粪便中华支睾吸虫卵核酸检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1实时荧光 PCR real
3、-time PCR在PCR扩增时加入带有荧光基团的特异性探针(Taqman探针)或荧光染料，使PCR产物的积累 与荧光信号的积累完全同步，实现PCR产物的实时监测。3.2Ct 值 cyclethresholdvalue每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语bp:碱基对(base pair)CTAB:十六烷基三甲基澳化筱(CetyltrithylammOniUm bromide)DNA:脱氧核糖核酸(CleOXyribOnUCIeiC acid)dNTP:脱氧核甘酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethyle
4、ne diaminetetraacetic acid)FAM:6-粉基荧光素(6-CarbOXyflUOreSCein)OD:光密度值(OPtiCal density)PCR:聚合酶链式反应(POlymeraSe chainreaction)T叫酶：从水生热栖菌中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶(thermus叫UatiCU)TEiTris-HCK EDTA 缓冲液Tris:三(羟甲基)氨基甲烷tris (hydroxymethyl) aminomethane5试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GBfT 6682中一级水的规定。所有 试剂均用无DNA酶污染的容器分
5、装。5. 1液氮5.2 0.5 mol/L EDTA 缓冲液(pH 8.0)。5. 3 CTAB 提取缓冲液(2.0% ): 20 g/L CTAB, 0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0 ), 1.4 mol/L NaCl,0.02 mol/L EDTA(pH 8.0)。6. 4 CTAB 沉淀液(0.5% ):5 g/L CTAB,40 mmol/L NaClo5.5 蛋白酶K溶液(20mgmL)5.6 NaCl 溶液(1.2moIL)5. 7三氯甲烷。5.8 三氯甲烷/异戊静(24 ： 1, VV)o5.9 异丙醇。5. 10 70% 乙醇。5. 11 TE 缓冲液:10
6、 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA 缓冲液(PH 8.0)。5.1 12 IOXPCR 缓冲液：10OmmOl/LKCl, 160 mmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LMgSo4, 200mmol/LTris- HCl(pH8.8), l%TritonX-100, ImgZmlBSAo如果具有等效的商品化试剂盒，则可使用这些等效产品。5.13 荧光PCR反应混合液OL反应体系包括:1 U 2 U(mit,酶学单位)的T叫酶、IXPCR缓冲 液、2.5 mmol/L 4.0 mmol/L 的 Mg2+、0.2 mmol/L 的 d (A, C
7、, G) TPs、0.2 mmol/L 0.4 mmol/L dUTP、 400 nmoI/L ROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。如果具有等效的商品化试剂盒，则可 使用这些等效产品。5.14 普通PCR引物华支睾吸虫的PCR检测所用的引物序列见表1。表1普通PCR引物序列名称序列目的基因名称5,端引物5 ,-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3细胞色素C氧化酶亚基13,端引物5,-ACTATCCCAGTAACCCCGCC-3,(coxl )基因5.15实时荧光PCR引物与探针：华支睾吸虫的实时荧光PCR检测所用的引物和探针序列见表2表2实时荧光PCR引物序列名称序列目的
8、基因名称5,端引物5TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3细胞色素C氧化酶亚基I (Coxl )基因3湍引物5 -AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3探针5 -FAM-AGCTC ATC ATATGTTTACTG-MGB-3,6仪器和设备6. 1实时荧光PCR仪。6.2 离心机：离心力不小于12 000 go6.3 离心管(1.5 mL, 2.0 mL)。6.4 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.5 微量移液器：2.5 L 20 J 100 pL、200 pL、1 000 Lo6. 6研钵或冷冻粉碎装置。6.7 恒温水浴锅或干式恒温器。6.8 天平：感量0.01 go
9、7检验步骤7.1 用液氮充分研磨至糜状;或采用合适的冷冻粉碎均质装置对样品进行充分地研磨至糜状。7.2 称取研磨后的样品200 mg于2.0 mL离心管中，加入1.5 mL 2.0% CTAB提取缓冲液和10 L 蛋白酶K溶液，65C30min,期间每隔Iomin振荡混匀；12OOOg离心IOmin,转移上清于洁净的离 心管中。7.3 加750 L三氯甲烷/异戊醇，混匀，12 OOOg离心5 min,转移上清液于洁净的离心管中7.4 加2倍体积CTAB沉淀液，室温静止60 min, 12 000 g离心15 min,弃上清。7.5 加入350LNaCl溶液将沉淀重悬浮。再加入350L三氯甲烷，
10、旋涡振荡进行混匀，120OOg离 心 10 min。7.6 转移上清后加入0.6倍体积的异丙醉用来沉淀核酸，室温放置20 min, 12 000 g离心IOmin, 弃上清。7.7 加入500 L 70%乙醇洗涤一次，晾干。7.8 加入100LTE,溶解沉淀。立即使用或一20C保存备用。也可以用等效的DNA提取方法提取 DNA模版。7.9 可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，按操作说明书进行操作。8 DNA的浓度和纯度测定样品DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光值A260和 A280o DNA的浓度按式(1)进行计算：c = A N 50(1)式中：
11、cDNA浓度，单位为纳克每微升(ngL);A260 nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当DNA浓度高于10 ngL, A260/A280比值在1.4 2.5之间时，DNA模板适宜于PCR扩增。9 PCR检测9. 1普通PCR检测9. 1.1 PCR 反应按表3配置25 L反应体系：表3 PCR反应体系成分用量（L）10PCR buffer (Mg2+)12.5上游引物(25 pmolL )1.0下游引物(25 PmoI/ u L )1.0Ex Taq DNA (5UL )1.0DNA模板5.0ddH2 水5.59.1.2 扩增程序及反应条件将PCR反应管置于PCR扩增仪，反应参数设置：第一阶段，
12、94 C预变性2 mino第二阶段，94 变性30 s、60 退火30 s、72 延伸30s,共30个循环。第三阶段，72 C延伸5 min,最后4保存。9.1.3 PCR产物的电泳检测用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溟化乙锭终浓度0.5 gmL）o将平板放入水平电泳槽 中，加入1TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物6 L与6 L上样缓冲液混合，分别 加入样品孔中，取5 L DNA Marker 100 bp加入到标准分子量对照孔内。5 V/cm恒压电泳30 min45 min o9.1.4 结果判定a）用凝胶成像系统进行分析。阳性样品扩增一条大小为231 bp的特异性条
13、带，阴性对照和空白 对照应无该特异性条带：在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则结果为阴性， 如被检样品有条带，大小为231 bp,即判定为华支睾吸虫卵核酸阳性。必要时取PCR扩增产 物进行序列测定，进一步确认待测样品的结果。b）如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，需重复试验，两次试验都为非特异性反应 时，可判为阴性。9.2实时荧光PCR检测9. 2. 1荧光PCR反应体系按表4配置25 L反应体系：表4荧光PCR反应体系成分用量（L）2荧光定量PCR预混液12.5上游引物(10 molL)1.0下游引物(10 molL)1.0探针(10 molL)1.0DNA模板5.0d
14、dH2O 水4.59.2.2荧光PCR反应参数在检测区进行。将9.2.1中加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参 数设置：第一阶段，95 30so第二阶段，95 5 s、60 30 s （在此收集荧光），40个循环。如试剂不同需要进行适当调整。2. 3结果判定9. 3.1结果分析条件设定读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根 据仪器噪音情况进行调整。10. 3. 2质控标准一阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线。一阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值W32.0；一一如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。11. 3. 3结果判定阴性无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无华支睾吸虫卵核酸，判定为华支睾吸虫卵核酸阴性。阳性检验样本CtW35.0,扩增出特定的扩增曲线，报告华支睾吸虫核酸阳性。检验样本35.0Ct值W40.0时，重复一次，如果Ct值仍然W40.0时,并且曲线有明显的对数增长 期，报告华支睾吸虫核酸阳性，否则报告华支睾吸虫核酸阴性。
