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1、植物与微生物的相互作用一、共生菌与病原菌的应用一、共生菌与病原菌的应用1.1利用工程化的共生菌保护植物免受冻害 定植于植物叶面的丁香假单胞菌在细胞表面产生一种冰成核蛋白（ice nucleation protein），在稍低于0以下的条件下，这种蛋白引起结冰，使作物遭受冻害，Steven Lindow及其研究小组利用DNA重组技术及同源重组技术得到Ice-突变株，使结冰温度下降到-9 。1.2 利用固氮菌提高作物产量化学固氮 转化条件苛刻：温度高于500，压力大于200atm。 大量施入田间的肥料流失，最终流入海洋，导致水体严重污染以及水中微藻及其它微生物大量繁殖。生物固氮 无需消耗燃料或电等
2、能源，不造成污染，过程复杂，需要酶（固氮酶和固氮酶的还原酶）的参与，消耗大量ATP， 需要严格无氧的微环境。二、二、农杆菌介导的植物转基因方法农杆菌介导的植物转基因方法植物转基因方法分为两类：一是直接基因转移方法一是直接基因转移方法:基因枪法、 PEG介导的原生质体法、花粉管通道法、电激转化法等，其中基因枪转化法是代表。二是生物介导的转化方法二是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。基因枪法优点：1 不受物种的限制2 只要构建基因表达盒（启动子启动子- -基因基因- -终止子终止子），不需
3、要构建在表达载体上3 没有农杆菌污染4 可以快速知道基因表达（瞬时表达，研究启动子功能）缺点：1 价格贵2 基因往往多拷贝插入原生质体转基因优点：原生质体转基因优点：1.不受物种的限制2.只要构建基因表达盒，不需要构建在表达载体上3.没有农杆菌污染4.可以研究基因瞬时表达缺点：操作比较麻烦、难度大（原生质体制备、转化、再生）Protoplast transformation of transgenic Valencia sweet orange plants with GFP by PEG-mediation一、农杆菌介导的（Agrobacterium-mediated ）转基因机理土壤农杆菌
4、（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤杆菌，在自然界中普遍存在，其特点是能感染双子叶植物，并引起植物形成肿瘤。天然的植物遗传工程天然的植物遗传工程土壤农杆菌的基因组与土壤农杆菌的基因组与Ti质粒组成质粒组成原因：原因：土壤农杆菌中Ti质粒上一段DNA（T-DNA，transfer DNA，编码生物碱和植物激素）转到了植物细胞基因组中，引起植物细胞旺盛分裂。（一）Ti质粒的结构毒性区毒性区肿瘤区肿瘤区冠瘿碱代谢区冠瘿碱代谢区复制区复制区 Ti质粒大约在160-240kb之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒
5、上还存在Con区（region encoding conjugation)和ori区（origin of replication)。auxA auxB cyt ocsLBRBLB, RB left and right borders (direct repeat)auxA + auxB enzymes that produce auxincyt enzyme that produces cytokininOcs octopine synthase, produces octopine 1.T-DNA 的结构 T-DNA上共有三套基因和左右两个边界。 左边界（左边界（left border）和右
6、边界（）和右边界（right border）：）：是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 生长素合成酶基因（生长素合成酶基因（tms）：）：由2个基因组成：tms1 （iaaM）和tms2（iaaH）； 细胞分裂素合成酶基因细胞分裂素合成酶基因tmr：由1个基因组成：ipt 冠瘿碱合成酶基因冠瘿碱合成酶基因tmt：冠瘿碱是含稀有氨基酸衍生物，称为opines，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine） 、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine）。被感染的植物诱导合成这些有机碱，但植物不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒
7、上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌作为氮源及碳源使用。根据冠瘿碱不同， Ti plasmids可以为几种： 1)胭脂碱型（Nopaline plasmids）: 带有带有在在 植物中合成植物中合成胭脂碱的基因和在的基因和在 细菌中代细菌中代谢、利用谢、利用胭脂碱的基因。形成的肿瘤可以的基因。形成的肿瘤可以分化出不定芽。分化出不定芽。 Nos启动子， Nos终止子。 2)章鱼碱（Octopine plasmids）:带有在带有在 植物中合成植物中合成章鱼碱的基因和在的基因和在 细菌中代谢、细菌中代谢、利用利用章鱼碱的基因。形成的肿瘤不能分化，的基因。形成的肿瘤不能分化，成为愈伤组织。成为愈
8、伤组织。 3)农杆碱型型（Agropine plasmids）:带有带有在在 植物中合成植物中合成农杆碱的基因和在的基因和在 细菌中代细菌中代谢、利用谢、利用农杆碱的基因。形成的肿瘤不分的基因。形成的肿瘤不分化，生长迟缓，死亡早。化，生长迟缓，死亡早。 4) 发根型（发根型（Ri plasmids）: 诱导毛状根或诱导毛状根或者肿瘤。者肿瘤。2. Vir (virulent) genes（毒性基因区，致病基因区 About 30 kb; virA,B,C,D,E,F,G (A-E are operons with multiple ORFs)； 受到受伤植物细胞释放的Acetosyringon
9、e (AS，乙酰丁香酮) 激活； 把Ti-质粒或者Ri-质粒的T-DNA 转移到植物细胞基因组中（转基因）。 virA - transports AS into bacterium, activates virG； virG - promotes transcription of other vir genes； virD2- endonuclease that cuts T-DNA at the borders but only on one strand; attaches to the 5 end of the SS of T-DNA； virE2- DNA-binding protei
10、n, binds SS of T-DNA； virD2 & virE2 also help T-DNA get to nucleus in plant cell, they have NLSs(核定位信号)； virB - 11 ORFs, helps DNA-protein complex get through cell membranes。（二）T-DNA的整合机制 T-DNA的详细整合机制尚不完全清楚，明确的： 农杆菌染色体上的基因（chvA, chvB, pscA等）决定与植物细胞的附着；植物损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Ti质粒上Vir（Vi
11、rulence region)基因的表达；Vir区编码的基因产物分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，形成单链T-DNA，并将其运到植物细胞核中，整合到核基因组中。由特异性内切酶完成。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列。 植物肿瘤植物肿瘤二、植物基因表达载体二、植物基因表达载体天然的天然的Ti质粒不能作为表达载体使用：质粒不能作为表达载体使用：a. 被转化的植物细胞产生大量的生长素和细胞分裂素，导致肿瘤的形成，阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因
12、。b. 冠瘿碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为冠瘿碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除冠瘿碱合成基因（tmt） c. Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。 d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。 植物细胞中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。 1. 植物细胞转化的共整合系统T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kan+。首先在E.coli中筛选重组分子，然后将
13、重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上， Kan+筛选转化细胞。共整合载体共整合载体 大肠杆菌大肠杆菌质粒质粒农杆菌农杆菌Ti质粒质粒重组农杆重组农杆菌菌Ti质粒质粒 2. 植物细胞转化的双元系统目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿
14、梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。 双元载体系统双元载体系统 目的基因表达盒目的基因表达盒pCAMBIA1305.111846 bpLac Z alphakanamycin (R)hygromycin (R)GUSPlusCatalase intronT-BORDER (R)pVS1 StaT BORDER (L)pBR322 bomNOS polyACaMV35S polyA2x CaMV35S promoterCaMV35S promoterpBR322 oripVS1 repBamH IBgl IIBst EIIBst XIEcoR IHind IIIKpn INco IPm
15、l IPst ISac ISal ISpe IXba INhe I (2026)Nhe I (5467)Xho I (8910)Xho I (10004)Sma I (11052)Sph I (11083)tgacaggatatattggcgggtaaac RBtggcaggatatattgtggtgtaaaca LB多多克克隆隆位位点点报告基因报告基因植物筛选基因植物筛选基因Kpn IXba I启动子启动子基因基因终止子终止子三、农杆菌介导的转基因步骤1.农杆菌准备：农杆菌准备：单菌落、试管中培养，再在三角瓶中放大培养（1：30-50稀释）至OD600=0.5-1。在培养结束前1h加20-1
16、00M AS可以促进农杆菌的转化。4000-5000rpm/4离心收集，再用植物培养基悬浮，备用。2.植物材料的准备：植物材料的准备：要求生长健壮、再生能力强、无菌；切成小片（小段）。3.感染：感染：将农杆菌液与植物材料混合，浸润10-30min。4.共培养：共培养：植物材料在无菌吸水纸上吸干农杆菌液后，转到共培养基上（共培养基常常含有AS），培养2天，转基因在此时间内完成。5.筛选与再生：筛选与再生：共培养结束后的植物材料转到选择与再生培养基上（含2种抗生素，分别抑制农杆菌和非转基因植物细胞生长）。6.转基因植物的鉴定与评价：转基因植物的鉴定与评价：报告基因、PCR、Southern blot、Northern blot、产物分析等。 图 农杆菌转化植物细胞 感染感染转化转化选择选择转基因植株评价与鉴定转基因植株评价与鉴定再生再生转基因植物的鉴定：转基因植物的鉴定：（1）检测报告基因）检测报告基因: GUS（编码葡萄糖苷酶）（编码葡萄糖苷酶）报告基因检测（报告基因检测（GUS染色）染色）GUS染色原理染色原理5-溴溴-4氯氯-3-吲哚葡萄糖吲哚葡萄糖苷，无色苷，无色兰色兰色分析启动子
