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1、血凝抑制实验报告篇1一、原理流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。二、应用该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。三、缺点只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI现象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。四、试验步骤1
2、阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g,加蒸储水至100inL,散热溶解后调PH值至6.L69kPal5min高压灭菌，4C保存备用。（3.8%枸椽酸钠（3.8g枸椽酸钠，100nll超纯水），IolkPa,2Omin高压灭菌，4保存备用,保存期1个月）。2 10%和1%鸡红细胞液的制备2.1 采血用注射器吸取阿氏液约ImL（3.8%枸檬酸钠），取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约24mL,与阿氏液混合（3.8%枸椽酸钠），放入装IOmL阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。
3、2.2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经15001800r/min离心8分钟，弃上清液,沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经15001800r/Inirl离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4C保存备用，不超过5天。2.310%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500-1800r/min8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积（InL）,加入9倍体积（mL）的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。（此步可省略，直接配制1%红细胞）2.4
4、1%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1mL,加入9mL生理盐水，混合均匀即可。（根据检测血清的数量，估算一下需要的1%鸡红细胞量，可按0.3ml每份血清）3抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1 在微量反应板的1孔12孔均加入251PBS（生理盐水），换滴头。3.2吸取25l抗原加入第l孔，混匀。3.3 从第1孔吸取25UL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25l加入第3孔,如此进行倍比稀释至第11孔,从第11孔吸取25B1弃之，换滴头。3.4 每孔再加入25lPBS（生理盐水）。3. 5每孔均加入251体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。3.6 振荡混匀，在室温
5、（2025C）下静置40Inin后观察结果（如果环境温度太高，可置4环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。3.7 结果判定将板倾斜，观察血凝板，判读结果。能使红细胞完全凝集（Io0%凝集，+）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（一）,否则此次检验无效。4血凝抑制（HI）试验（微量法）4.1根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256,则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。4.2在微
6、量反应板的1孔11孔加入251PBS（生理盐水），第12孔加入50口1PBS（生理盐水）。4.3吸取251血清加入第1孔内，充分混匀后吸251于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25Pl弃去。4.41孔11孔均加入含4HAU抗原25口1,室温（约20）静置至少30mi11o4.5每孔加入25ul1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20,若环境温度太高可置4条件下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4.6结果判定试验成立的条件：只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2,阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作
7、为HI滴度。HI价小于或等于31og2判定HI试验阴性；HI价大于或等于41og2为阳性。五、HI试验注意事项1、合理选择抗原和对照阳性血清。针对Re-4和Re-5株疫苗免疫采用相应抗原和对照阳性血清。同一亚型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株来源不同，则可能会存在抗原性差异，从而使检测同一血清的结果有差别。一般来讲，疫苗种毒株如果与抗原所用毒株相同时，则所测得的Hl效价较高。2、合理使用和保存抗原。反应试剂要按规定保存和使用，冻干的试剂应按照说明中规定的体积重新溶解并保存。要避免杂菌污染，因为污染所造成的非流感起源的凝集素也可与所有抗血清发生非特异反应。为避免反复冻融和细菌污染，可以无菌操作将
8、试剂分装成小包装。3、反应温度不能太高。若在37（如温箱）下进行。血凝抑制实验报告篇2随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。应用：用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。下面以新城疫病毒为例，介绍血凝和血凝抑制试验的方法：注意事项：一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般100O只以下的鸡群采样率在25%;5
9、000只以下12%；5000只以上0.51%。对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸储水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。每只鸡采血量在Ilnl左右，最好不低于InIL在室温下静置至血清自然析出。二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法
10、：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续78分钟。另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。血凝与血凝抑制试验的操作方法一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。二、方法：
11、1%鸡红血球的制备：1 .用长针刺入鸡心脏或翅下静脉，采血，采血量视用量而定，5%抗凝剂与全血的比例为1：34。2 .洗血球：共洗45次，每次58分钟，红血球与生理盐水的比例至少为1：23。离心机转速为每分钟15003000转，最后倾去上清。3 .吸红血球泥Iml加生理盐水99ml,配成1%红血球备用。三、血凝试验：1.血凝板上12个孔内全部加入生理盐水，每孔0.05mL吸等量新城疫抗原于第一孔内，混匀后吸出同量于第二孔内混匀，以此类推稀释至第11孔，并弃去0.05ml,留第12孔作为生理盐水对照，然后全部孔内加入1%鸡红血球。4 .将血凝板置于振荡器上振荡12分钟，使材料充分混均，放入恒温培
12、养箱，每5分钟观察一次，至1015分钟取出，一般以生理盐水对照孔的图象清析地出现为准。5 .结果判定：红血球在反应板底部全部均匀铺开为完全凝集（+）,在血凝板底部集为一小红点为沉淀（一），如底部为一小红点，四周为凝集的红细胞，则为不完全凝集（+）。6 .出现完全凝集的抗原的最高稀释度，即为该抗原的凝集价。7 .四单位抗原的制备：血凝试验的结果如为28（256）,则前移2孔即26（64）,作为四单位抗原的稀释度。即：63ml生理盐水+Iml抗原即为四单位抗原。四.血凝抑制试验：1 .血凝板上111孔全部加入O.05ml的生理盐水，于第一孔内加入等量的被检抗体，稀释至第10孔，弃去0.05mL再加
13、入等量的4单位新城疫抗原至第11孔，第11孔为抗原对照，12孔为生理盐水对照。在振荡器上振荡12分钟，放置室温约20分钟，然后加入等量的1%鸡红血球，振荡后放入恒温培养箱大约1015分钟后进行结果判定。2 .结果：能完全抑制红细胞凝集的被检抗体的最高稀释度为该被检抗体的血凝抑制滴度。注：1、Hl价在2324时免疫可产生良好的免疫应答，如在疫区可提高到2425免疫。2、2425HI210时为最好。3、如HI价高于211则为强毒污染。注：#为完全抑制，+为不完全抑制，一为不抑制。血凝抑制实验报告篇3禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是
14、目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大,经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。一、血凝试验操作程序1、取96孔90oV形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的12孔每孔加25ULPBS液。2、吸取25IXL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。3、从第1孔吸取25IIL混匀后的抗原液加到
15、第2孔中，混匀后吸取25L加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25ULo第三排孔至第四排孔同上操作。4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25L1%的鸡红细胞悬液。5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25C）静置30Inin观察结果（如果环境温度太高，可置4C环境下）。6、结果判定：将板作45。倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即IHAU抗原除以4）2、取96孔V形酶标板，用移液器在第12孔各加入25LPBSo3、在第1孔加入25口L被检血清，充分混匀后移出25UL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25U4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清(各做两份)，作对照孔。5、在第12孔各加入25UL4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25C下静置30mino6、每孔加入25UL1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温(20-25C)静置40Inin后观察结果，若环境温度过高，可于4条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2,阳性对照孔误差不超过1个滴
