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1、辅前INAD（三）含试剂盒说明书微法100管/48样注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：辅酶INAD（三）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖醇解（EMP）和三粉酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的NADH经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成ATP的同时，形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD（三）含量和NADHNAD比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD（三）及NADHNAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH
2、/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。渊定原理：分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH,NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型曝嚏蓝（MTT）为甲瓒，在57Onm卜.检测吸光值；而NAD+可被乙静脱氢酶还原为NADH,进一步采用MTT还原法检测。需自备的仪器和用品：酶标仪、台式离心机、移液器、96孔板、研钵、冰和蒸谣水。试剂的组成和配制：酸性提取液：液体50mLxl瓶，4C保存；碱性提取液：液体50mLxl瓶，4C保存；试剂一：液体IOmLXl瓶，4C保存；试剂二：液体3mLl瓶，4C保存；试剂三：
3、粉剂Xl瓶，-20aC保存，用时加入3mL蒸馆水，混匀，用不完的试剂4保存一周；试剂四：粉剂Xl瓶，4C保存，用时加入3mL蒸储水，混匀，用不完的试剂4C保存一周；试剂五：液体3.6mLxl瓶，4tC保存：试剂六：液体30mLxl瓶，4aC保存；试剂七：液体50mLxl瓶,4aC保存。NAD+和NADH的提取：1血清（浆）中NAD+和NADH的提取：NAD的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：510的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入ImL酸性提取液），95水浴5min（盖紧，以防止水分散失）：冰浴中冷却后，100OOg4C离心IOmin;取500L上清液,加入
4、500L碱性提取液使之中和,混匀，100OOg4匕离心Iomin,取上清,置冰上待测。NADH的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为1：510的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入ImL碱性提取液），95C水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，100OOg4C离心IOmin;取500L上清液,加入500L酸性提取液使之中和，混匀，10000g4*C离心Iomin,取上清,置冰上待测。2组织中NAD+和NADH的提取:NAD的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议取约OJg组织，加入ImL酸性提取液），冰浴研磨，95C水
5、浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g4离心IOmin;取500L上清液，加入500L碱性提取液使之中和，混匀，100Oog4C离心Iomin,取上清，置冰上待测。NADH的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为1：510的比例（建议取约0.1g组织，加入ImL碱性提取液），冰浴研磨，95C水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，100Oog4匕离心IOmin;取500L上清液，加入500L酸性提取液使之中和，混匀，10000g4匕离心IOmin,取上清，置冰上待测。3细胞或细菌中NAD+和NADH的提取：NAD的提取：先收集细胞或细菌到离心管内
6、，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：酸性提取液体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入ImL酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次），95水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，IoooOg4C离心IOmin;取500L上清液,加入500L碱性提取液使之中和,混匀，10000g4*C离心Iomin,取上清,置冰上待测。NADH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（IO4个）：碱性提取液体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入ImL碱性提取液），超声波破
7、碎（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次），95C水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，IoOOOg4离心IOmin；取500L上清液，加入500L酸性提取液使之中和，混匀，10000g4tC离心IOmin,取上清，置冰上待测。浦定步Ilh1、分光光度计或衡标仪预热30min以上，调节波长至570nm,蒸储水调零。2、加样表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）：试剂名称（L）对照管测定管样本2020试剂一8080试剂二3030试剂三3030试剂四3030试剂五3030试剂六200混匀，室温避光静置20min试剂六200充分混匀，静置5min后，200
8、00g,25C离心5min,弃上清，沉淀中加入:试剂七400400混匀，取200L转移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm卜.读取对照吸光值Al和测定管吸光值A2,计算4A=A2-A10注意事项：1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。3、反应过程中注意避光。4、若NAD+测定中（A2-A1）O.O3O2,NADH测定中AA（A2-A1）0.0222,说明样本中辅酶含量较低，己低于检测限，可做如卜.调整：(1
9、)将测定管避光静置时间20min延长到60min;(2)在提取阶段增加取样量，即取0.2g样本或0.2mL样本加入ImL提取液。5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒100管保证测48个NAD-或NADH.NAD+和NADH含的计售：(一)NAD+含量的计算标准条件下的回归曲线为y=0.1475x+0.0302,R2=0.9978；其中y为AA,X为NAD+浓度nmol/mL1、血清(浆)中NAD+含量计算NAD+含量(nmol/mL)=(A-0.0302)0.1475Vl)(V3V1V2)=135.6(A-0.0302)2、组织、细菌或细胞中NAD+含量计算(D按样本蛋白浓度计算NA
10、D+(nmol/mgprot)=(A-0.0302)0.1475Vl)(VlCpr)=6.8(A-0.0302)Cpr(2)按样本鲜重计算NAD+(nmolg鲜重)=(A-0.0302)0.1475V1)(WV1V2)=13.6(A-0.0302)W(3)按细菌或细胞密度计算NAD+(nmol/IO4cell)=(A-0.0302)0.1475VI)(500V1V2)=0.027(A-0.0302)(二)NADH含量的计算标准条件下的回归曲线为y=0.1404x+0.0222,R2=0.9976；其中y为AA,X为NADH浓度nmol/mL1、血清(浆)中NADH含量计算NADH含量(nmol
11、/mL)=(A-0.0222)0.1404Vl)(V3V1V2)=142.5(A-0.0222)2、组织、细菌或细胞中NADH含量计算(D按样本蛋白浓度计算NADH(nmol/mgprot)=(A-0.0222)0.1404Vl)(VlCpr)=7.1(A-0.0222)Cpr(2)按样本鲜重计算NADH(nmolg鲜重)=(A-0.0222)0.1404V1)(WV1V2)=14.2(A-0.0222)W(3)按细菌或细胞密度计算NADH(nmol/IO4cell)=(A-0.0222)O.14O4V1)(500V1V2)=0.028(A-0.0222)VI：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL：V3：加入血清(浆)体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。注意：最低检测限为O.lnmol/mL或0.1nmolg鲜重或0.00InmOImgprol咽优利科(上海)生命科学有限
