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1、第六节第六节蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein一、理化性质一、理化性质 （一）蛋白质的两性电离性质（一）蛋白质的两性电离性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric p
2、oint,pI)当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点蛋白质的等电点。（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1 1万至万至100100万万或更大，由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形或更大，由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。其分子的直径可达成胶体溶液。其分子的直径可达1 1100nm100nm，为胶粒范，为胶粒范围之
3、内。围之内。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。*蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素:颗粒表面电荷、水化膜颗粒表面电荷、水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱
4、酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉（三）很多因素可引起蛋白质的变性（三）很多因素可引起蛋白质的变性*蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)：在某些物理和化在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失；质改变和生物活性的丧失；*变性后的蛋白质称为变性后的蛋白质称为变性蛋白变性蛋白；造成变性的因素造成变性的因素温度（热、温度（热、冷冷）加热；）加
5、热；强酸、强碱；强酸、强碱；尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏尿素和盐酸胍的影响（破坏分子内部氢键、破坏疏水效应）；疏水效应）；表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（表面活性剂的影响：如十二烷基硫酸钠（SDSSDS）等）等 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等；食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等；此外此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件
6、。制剂（如疫苗等）的必要条件。应用举例应用举例复性复性(renaturation)若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为能，称为复性复性；类型：不可逆变性、可逆变性（可复性）。类型：不可逆变性、可逆变性（可复性）。尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性非折叠状态，非折叠状态，无活性无活性（四）蛋白质的沉淀作用（四）蛋白质的沉淀作用蛋白质沉淀蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链在一定
7、条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而蛋白质从溶液中析出；融会相互缠绕继而聚集，因而蛋白质从溶液中析出；变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性；性；蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中；坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中；蛋白质的沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀蛋白质的沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。1、可逆沉淀、可逆沉淀在温和条件下，通过改变溶液的在温和条件下，通过改变溶液的pHpH或电荷状况，或电荷状
8、况，使蛋白质从胶体溶液中使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离沉淀分离。在沉淀过程中，在沉淀过程中，结构和性质结构和性质都没有发生变化，在都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为种沉淀又称为非变性沉淀非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。盐析盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象（氯化钠）使蛋白质沉淀
9、析出的现象（水与离子的相互作用水与离子的相互作用增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用；同时瓦解了以增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用；同时瓦解了以电荷为基础的蛋白质分子之间的作用电荷为基础的蛋白质分子之间的作用）。）。盐溶：盐溶：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐溶。溶。等电点沉淀法等电点沉淀法（脱去水化层、降低介电常数）脱去水化层、降低介电常数）。在低温下或缩短处理时。在低温下或缩短处理时间可防止或减缓变性。间可防止或减缓变性。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 2、不可逆沉淀、不可逆沉淀在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶在强烈
10、沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。（五）蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰（五）蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰大部分蛋白质均含有带芳香环的大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨
11、酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在这三种氨基酸的在280nm 280nm 附近有附近有最大吸收最大吸收。因此，大多数蛋白质在因此，大多数蛋白质在280nm 280nm 附近显示强的附近显示强的吸收；吸收；蛋白质的蛋白质的ODOD280280与其与其浓度浓度呈正比关系，可以呈正比关系，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。（六）蛋白质的呈色反应可用于溶液蛋白质测定（六）蛋白质的呈色反应可用于溶液蛋白质测定蛋白质经水解后产生茚三酮反应蛋白质经水解后产生茚三酮反应蛋白质经蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应水解后产生的氨基酸也可发生茚三
12、酮反应(ninhydrin reaction)。肽链中的肽键可与双缩脲试剂反应肽链中的肽键可与双缩脲试剂反应蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)，双缩脲反应可用来检测蛋白，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。质水解程度。二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化 纯化的目标纯化的目标 尽量提高蛋白质的尽量提高蛋白质的纯度纯度或或比活性比活性，设法除，设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽可能提高蛋去变性的和不需要的蛋白质，尽可能提高
13、蛋白质的产量。白质的产量。（一）蛋白质分离纯化的一般原则（一）蛋白质分离纯化的一般原则 1 1）从组织细胞中溶解放出蛋白质）从组织细胞中溶解放出蛋白质，并保持天，并保持天然状态，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌然状态，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌 酶破酶破壁、破膜，再用溶剂提取。壁、破膜，再用溶剂提取。2 2）分离所需要蛋白质与其他蛋白质）分离所需要蛋白质与其他蛋白质 a a 等电点沉淀等电点沉淀 b b 盐析和有机溶剂分级分离盐析和有机溶剂分级分离 1、天然蛋白质的分离、天然蛋白质的分离4 4）结晶提纯）结晶提纯 a a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白；多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白；b b 结晶的
14、最佳条件：略过饱和溶液；结晶的最佳条件：略过饱和溶液；各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。3 3）纯化：）纯化：a a 离子交换层析离子交换层析 b b 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 c c 亲和层亲和层 析析 d d 电泳方法电泳方法 e e 疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱（二）透析及超滤法（二）透析及超滤法*透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。开的方法。*超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质
15、溶液透过有一定截留应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。透析的示意图透析的示意图（三）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（三）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。*盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白
16、质溶液，使蛋白质表面或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。沉淀。将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。免疫沉淀法（免疫沉淀法（immunoprecipitation)（四）利用荷电性质可将蛋白质采用（四）利用荷电性质可将蛋白质采用电泳法进行分离电泳法进行分离蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带电的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术质的技术,称为称为电泳电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。胶电泳等。*SD
