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1、总蛋白测定及白蛋白测定实验目的:熟悉血清蛋白的测定方法(双缩脲法)。掌握血清总蛋白测定的临床意义。进一步巩固掌握721E型分光光度计的使用。熟悉血清白蛋白的测定方法(溴甲酚绿法)。掌握血清白蛋白的测定和白蛋白和球蛋白的含量比(A/G)测定的临床意义。测定化合物或混合物中总氮量的一种方法,即在催化剂条件下,用浓硫酸将有机氮转化为无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,然后用过量的酸液吸收用标准碱滴定,这样就可以算出样品 中的总 氮量。由于一般氮元素质量占蛋白质质量的 16%,故样品中蛋白质含量=含氮量*6.25实验试剂n生理盐水:NaCl 0.9g 溶于100ml蒸馏水n双缩脲试剂:硫酸铜 3
2、.0g溶于500ml蒸馏水,加酒石酸钾钠9.0g,碘化钾5.0g,完全溶解后,加入24%NaOH100ml,用蒸馏水稀释到1L,置聚氯乙烯瓶内盖紧保存。n蛋白质标准液:收集混合血清,经凯氏定氮法凯氏定氮法定值,用作蛋白质标准液。贮于冰箱中备用。也可用100mg/ml牛血清白蛋白替代。n待测血清用生理盐水1:10稀释。实验操作测定管 标准管 空白管 血清(ml)1.00蛋白质标准液(ml)1.00生理盐水(ml)1.00双缩脲试剂(ml)5.0 5.0 5.0 取3支试管,按下表操作。混匀,37水浴放置10分钟,以空白管调零点,在540nm波长处进行比色,分别读取各管的吸光度。计算公式(P65)
3、试剂1.溴甲酚绿(BCG)贮存液 取BCG 419mg,用10ml 0.1mol/L NaOH溶解,加NaN3 100mg,定容至1000mL。贮于棕色瓶备用。如用溴甲酚绿钠盐应称取432mg.加水溶解。2.0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.2)分别配制0.1mol/L柠檬酸和柠檬酸钠溶液,然后按12.3:7.7的体积比例混合。每1000ml混合液加入NaN3 100mg。3.30%聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)溶液 取Brij-35 30g,加少量水,60水浴溶解,加水至100ml(此可用Tween-20或Tween-80代替)。4.BCG应用液 BCG贮存液250ml,0.1mo
4、l/L柠檬酸缓冲液(pH4.2)750ml,30%Brij-35 8ml(也可以用Tween-20 8ml或Tween-80 10ml代替)混合而成。5.标准蛋白溶液(10mg/ml)称取人白蛋白1.00g,用生理盐水1234白蛋白标准液 (ml)0.100.200.400.60生理盐水(ml)0.900.800.600.40稀释后白蛋白含量(mg/ml)1.02.04.06.0注意事项1.由于各种血清蛋白质的分子量不同,故其浓度不宜用mol/L表示。2.双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子,以维持铜离子在碱性溶液中的溶解性;碘化钾能防止两价铜离子还原3.高脂,黄疸及溶血标本应作清空白对照
5、来校正误差。含脂类极多的血清,加入双缩脲试剂后会出现混浊,可用乙醚3ml抽提后再进行比色4.血清白蛋白浓度100g/L时,需作稀释处理,结果乘上稀释倍数2.血清白蛋白测定用生理盐水按1:10的比例稀释血清,取稀释后的血清0.2ml加入BCG应用液5.0ml混匀后立即同上比色,读取光密度,并从标注曲线上查出相应的白蛋白浓度。3.白蛋白/球蛋白比值(A/G比值)用双缩脲法测定血清标本中的总蛋白浓度,用总蛋白浓度减去白蛋白浓度即得球蛋白浓度,并可求的A/G比值:A/G比值比值=白蛋白含量白蛋白含量总蛋白含量总蛋白含量-白蛋白含量白蛋白含量临床意义n1.清总蛋白生理性波动:长久卧床者比直立活动者约低35g/L;新生儿比成人低58g/L;60岁以上的老人约比青壮年低2g/L。n2.清总蛋白增高:n血液浓缩:腹泻、呕吐等。n合成增加:如多发性骨髓瘤等。n3.清总蛋白降低:n血液稀释:过多注射低渗溶液,各种原因引起的水钠潴留。n摄入量不足和消耗增加:营养不良、慢性肠胃炎、严重结核病等。n合成障碍:肝脏疾病。n蛋白质丢失:严重烧伤时大量血浆渗出,肾综合症等。