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1、质粒三种提取方法的比较基因工程原理与技术实验部分：质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子染色体外的稳定遗传因子,大小从大小从1-200kb不等不等,为双链、闭环的为双链、闭环的DNA分子分子,并并以超螺旋状态存在于宿主细胞中以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的外，还会产生其它形式的质粒质粒DNA。如果
2、质粒。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多两条链中有一条链发生一处或多处断裂处断裂,分子就能旋转而消除链的张力分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状形成松驰型的环状分子分子,称开环称开环DNA(Open circular DNA,简称简称 ocDNA)；如；如果质粒果质粒DNA的两条链在同一处断裂的两条链在同一处断裂,则形成线状则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒。当提取的质粒DNA电泳时电泳时,同一质粒同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。速度快。实验目的：1、学会小量制备质粒DNA的碱
3、裂解方法、煮沸法、小量一步提取法这三种质粒DNA的提取方法。2、三种方法的比较，能够根据不同的实验目的选择合适的方法。实验原理：碱变性原理：根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会，在变性后不会分离，复性
4、快；分离，复性快；DNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性染色体染色体线性线性DNA和或和或有缺口有缺口的质粒的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性变性煮沸法：煮沸法：将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相
5、缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA 由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快于细菌染色体DNA。小量一步提取法：从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:1、培养细菌使质粒扩增 2、收集和裂解细胞 3、分离和纯化质粒DNA 材料、设备及试剂 一、材料一、材料 含卡那酶素的E.coli DH5，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心
6、管架。二、设备二、设备 微量取液器(20l,200l,1000l)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。三、试剂三、试剂 1、LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract)5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。3、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液,-
7、20保存备用。4、溶菌酶溶液：用10mmol/L TrisCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20,每一小份一经使用后便予丢弃。5、3mol/l NaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81g NaAc3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2,加水定容至100ml,分装后高压灭菌,储存于4冰箱。6、溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。溶液可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4冰箱。7、溶液：0.2 mol/L NaOH(临用前用5-10mol/L
8、 NaOH母液稀释)，1 SDS。8、溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml,并高压灭菌。溶液终浓度为:K+3mol/L,Ac 5mol/L。9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5),15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20。10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1的8-羟基
9、喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L TrisCl(pH8.0)和0.1mol/L TrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。11、氯仿:按氯仿:异戊醇24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。12、TE缓冲液：10 mmo/L TrisCl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4冰箱中。13、STET：0.
10、1 mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)，5%Triton X-100。14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。15、电泳所用试剂：（1）TBE 缓冲液(5)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。（2）上样缓冲液(6)：0.25%溴酚蓝，40%(w/v)蔗糖水溶液。操 作 步 骤 一、一、细菌的培养和收集细菌的培养和收集 将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含5
11、0g/ml Amp)中,37培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50g/ml Kan)中,37振荡培养约12小时至对数生长后期。二、二、质粒质粒DNA少量快速提取少量快速提取 质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。（一）、煮沸法 将振荡过夜培养的细菌1.5ml，于8 000r/min离心1min，弃上清液。将沉淀回溶于350L STET(0.1 mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，10
12、 mmol/L EDTA(pH8.0)，5%Triton X-100。)中。加入25L溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于10 000r/min离心10min。吸出上清移至另一个Eppendolf 管中或用已灭菌的牙签小心地将沉淀去除，加入 40L2.5mol/LNaAc（PH5.2）和420L冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5 min。12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次，然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。用20L无菌水溶解沉淀，于20冻存 试验步骤：（二）、碱裂解法 1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4下10000rpm
13、离心5min。2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于150l溶液中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。4、加入新配制的溶液300l,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡千万不要振荡),冰浴5分钟。5、加入227l预冷的溶液,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),颠倒混匀,4下12000g离心5分钟，重复一次。7、将水相移入干净eppendorf管中,加入0.6-1倍体积的异丙醇,颠
14、倒混匀静置10分钟，然后12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入100ul 70 乙醇洗沉淀两次。9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。10、将沉淀溶于20-50l 无菌水中，储于-20冰箱中。1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一般使用等体积),无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。注意注意1.取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 2.加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min，充分混匀。3.12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中，加入500l异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。4.弃上清，加入500l70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。5.弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20l无菌水溶解DNA。（三）小量一步提取法1、碱裂解法提取质粒DNA时应注意哪些问题？溶液、溶液、溶液的作用？2、描述质粒DNA的电泳图谱，并解释产生的现象及可能的原因？思考题
