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1、鸡鸡-防御素防御素-1重组毕赤酵母的重组毕赤酵母的制备与表达制备与表达概述概述 -防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽，除了具防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽，除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外，它还参与机体免疫有直接的杀菌、抗病毒作用外，它还参与机体免疫反应，如今由于抗生素的滥用引发的问题而日益引反应，如今由于抗生素的滥用引发的问题而日益引起人们广泛关注。起人们广泛关注。动物防御素具有代替传统抗生素的潜力，主要动物防御素具有代替传统抗生素的潜力，主要表现在：抗菌谱广，免疫原性无或低，对人畜无毒表现在：抗菌谱广，免疫原性无或低，对人畜无毒副作用，无残留，无耐药性，热稳定性和溶解性良副作用，无残留，无耐药
2、性，热稳定性和溶解性良好，对较高离子强度或较大好，对较高离子强度或较大pH变化耐受性较好。因变化耐受性较好。因此，防御素越来越受到研究人员的关注。此，防御素越来越受到研究人员的关注。防御素防御素 防御素是一类碱性阳离子抗菌肽，相对分子质防御素是一类碱性阳离子抗菌肽，相对分子质量为量为3500-4500左右，分子中含有左右，分子中含有6-8个保守的半胱个保守的半胱氨酸残基，形成氨酸残基，形成3-4对分子内二硫键，并通过半胱氨对分子内二硫键，并通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的-片状结构片状结构。根据其分子内半胱氨酸的位置和连接方式及前体。根据其分子内半
3、胱氨酸的位置和连接方式及前体性质的差异可分为性质的差异可分为-防御素、防御素、-防御素、防御素、-防御素防御素、昆虫防御素和植物防御素。防御素具有广谱抗微、昆虫防御素和植物防御素。防御素具有广谱抗微生物作用，包括各种细菌、真菌和一些具膜病毒，生物作用，包括各种细菌、真菌和一些具膜病毒，为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障。为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障。抗菌机理抗菌机理 防御素种类多种多样，抗菌谱也各不相同。不防御素种类多种多样，抗菌谱也各不相同。不同的防御素的作用方式可能不同，同一种防御素与同的防御素的作用方式可能不同，同一种防御素与不同微生物作用时机理也可能不同。防御素的杀菌不同微生
4、物作用时机理也可能不同。防御素的杀菌机理主要有以下几种：机理主要有以下几种：1.破坏细胞膜，形成离子通道破坏细胞膜，形成离子通道 防御素可以通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结防御素可以通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结合，其疏水部分在疏水作用和分子张力作用下，能够改变细合，其疏水部分在疏水作用和分子张力作用下，能够改变细胞膜的流动性和厚度，从而使细胞膜上出现孔洞，导致细胞胞膜的流动性和厚度，从而使细胞膜上出现孔洞，导致细胞质外渗或细胞外的物质进入到细胞内，严重时会引起细胞膜质外渗或细胞外的物质进入到细胞内，严重时会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡。崩解，导致细胞死亡。抗菌机理抗菌机理2.抑
5、制胞外大分子的合成抑制胞外大分子的合成 防御素对肽聚糖、几丁质及一些生物大分子合成、交联防御素对肽聚糖、几丁质及一些生物大分子合成、交联的抑制也可能是其重要的杀菌机理之一。的抑制也可能是其重要的杀菌机理之一。3.抑制胞内功能抑制胞内功能 防御素也能够破坏某些重要的胞内过程，从而促进细胞防御素也能够破坏某些重要的胞内过程，从而促进细胞死亡。在某些实验中发现微生物能够在膜不完整的情况下存死亡。在某些实验中发现微生物能够在膜不完整的情况下存活更长的时间，这就预示着防御素可能有非膜破坏杀菌机制活更长的时间，这就预示着防御素可能有非膜破坏杀菌机制的存在。的存在。抗病毒机理抗病毒机理 防御素抑制和杀伤肿瘤
6、细胞的机制与杀防御素抑制和杀伤肿瘤细胞的机制与杀菌的机制不尽相同，它比杀菌机制更为复杂菌的机制不尽相同，它比杀菌机制更为复杂。一方面，它能通过其细胞毒性，主要是对。一方面，它能通过其细胞毒性，主要是对细胞膜、核膜、线粒体、细胞核染色体和细细胞膜、核膜、线粒体、细胞核染色体和细胞骨架等的损伤来达到杀伤肿瘤细胞的效果胞骨架等的损伤来达到杀伤肿瘤细胞的效果；另一方面，防御素能通过调动机体免疫机；另一方面，防御素能通过调动机体免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵。能，从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵。防御素的应用现状防御素的应用现状1 在医药行业的应用在医药行业的应用 细菌对传统抗生素的耐药性是
7、当今全球性难题，防御素细菌对传统抗生素的耐药性是当今全球性难题，防御素因其具有广谱的抗菌活性，独特的抗菌机理，并与典型的因其具有广谱的抗菌活性，独特的抗菌机理，并与典型的抗生素具有协同作用，能中和内毒素，调节机体免疫应答抗生素具有协同作用，能中和内毒素，调节机体免疫应答和炎症反应，调节组织创伤修复等特点引起了人们的广泛和炎症反应，调节组织创伤修复等特点引起了人们的广泛关注关注2 在食品行业的应用在食品行业的应用 在食品方面，防御素主要用作防腐剂，防止食品腐败变在食品方面，防御素主要用作防腐剂，防止食品腐败变质。质。防御素的应用现状防御素的应用现状3 在农业上的应用在农业上的应用 防御素在农业中
8、可用于农作物抗病育种。防御素在农业中可用于农作物抗病育种。4 在畜牧业上应用在畜牧业上应用 防御素作为饲料添加剂对细菌具有很强的抑制防御素作为饲料添加剂对细菌具有很强的抑制作用，能够促经畜禽生长，提高饲料的利用率，作用，能够促经畜禽生长，提高饲料的利用率，动物在采食以后不会再体内残留。动物在采食以后不会再体内残留。酵母表达系统酵母表达系统 酵母是目前研究比较成熟的一种表达系酵母是目前研究比较成熟的一种表达系统，研究表明，防御素在酿酒酵母中的表达统，研究表明，防御素在酿酒酵母中的表达水平较低，而选用毕赤酵母则可获得高效表水平较低，而选用毕赤酵母则可获得高效表达，其表达水平高达达，其表达水平高达7
9、0 mg/L，且重组肽具有，且重组肽具有与天然肽相似的二级结构和生物活性。与天然肽相似的二级结构和生物活性。酵母表达系统酵母表达系统 作为外源蛋白表达系统，毕赤酵母有其独特的作为外源蛋白表达系统，毕赤酵母有其独特的优势：遗传操作简单；对重组蛋白可以进行翻译后优势：遗传操作简单；对重组蛋白可以进行翻译后加工修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；具加工修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；具有强有力的乙醇氧化酶有强有力的乙醇氧化酶(AOXI)基因启动子，可严格基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；对需氧生长有强的偏好，这调控外源蛋白的表达；对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，
10、表达量高，一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，对工业放大生产有利；毕赤酵母自身分泌的蛋白对工业放大生产有利；毕赤酵母自身分泌的蛋白(背背景蛋白景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。防御素毕赤酵母的构建及筛选防御素毕赤酵母的构建及筛选 利用利用 TRNzol 试剂盒从安徽三黄鸡肝脏中抽提总试剂盒从安徽三黄鸡肝脏中抽提总 RNA，并进行电泳检测；根据并进行电泳检测；根据 Genbank 中登录的鸡中登录的鸡-防御素防御素-1基基因序列，设计一对特异性引物，利用设计的引物扩增因序列，设计一对特异性引物，利用设计的引物扩增 Gal-1 成熟肽基因片段；
11、将此片段与成熟肽基因片段；将此片段与 pMD-18-T 载体相连，构建重载体相连，构建重组克隆载体组克隆载体pMD-18-Gal-1，转化大肠杆菌，转化大肠杆菌 DH5 后进行鉴后进行鉴定、序列测定；后将测序正确的目的片段与载体定、序列测定；后将测序正确的目的片段与载体 pPIC3.5K 连接，构建重组表达质粒连接，构建重组表达质粒 pPIC3.5K-Gal-1，单酶切后用电转，单酶切后用电转化的方法将构建的重组表达载体整合入毕赤酵母化的方法将构建的重组表达载体整合入毕赤酵母 GS115 中，中，然后进行了高拷贝的筛选和表型的鉴定。然后进行了高拷贝的筛选和表型的鉴定。高拷贝筛选高拷贝筛选 一般
12、情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。数越多，蛋白表达量就越高。pPIC3.5K 含有含有 neo 基因，赋予毕赤酵母基因，赋予毕赤酵母 G418 抗性。而抗性。而 G418 抗性水抗性水平主要依赖整合的平主要依赖整合的 neo 基因的数目。单拷贝基因的数目。单拷贝 pPIC3.5K 整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵整合入毕赤酵母基因组后，赋予毕赤酵母约母约0.25 mg/mL的的 G418 抗性水平。因此可以通过抗性水平。因此可以通过 G418 抗性水平初步推断该克隆所包含的拷贝数。抗性水平初步推断该克隆所包含的拷贝数。高拷贝
13、筛选高拷贝筛选 实验中使用浓度分别为实验中使用浓度分别为0，50，100，200，300 g/mL的的 G418 来进行高拷贝的初步筛选，然后进来进行高拷贝的初步筛选，然后进一步通过实时定量一步通过实时定量 PCR 来验证，两者结果基本一来验证，两者结果基本一致。但也有研究发现高拷贝与高表达并不一定对应致。但也有研究发现高拷贝与高表达并不一定对应。因此，基因拷贝数对表达量的影响还无法预测，。因此，基因拷贝数对表达量的影响还无法预测，高表达菌株的筛选只应以表达蛋白量的高低作为唯高表达菌株的筛选只应以表达蛋白量的高低作为唯一标准。因此还需要进行下一步的表达工作来证明一标准。因此还需要进行下一步的表
14、达工作来证明高拷贝是否能提高重组高拷贝是否能提高重组 Gal-1 的表达量。的表达量。转化子表型的鉴定转化子表型的鉴定 外源蛋白在酵母基因组中的整合方式有两种：外源蛋白在酵母基因组中的整合方式有两种：一种是在一种是在 His4 或或5AOX1启动子区域，酵母染色体启动子区域，酵母染色体上的上的 AOX1 基因保持完整，这种整合产生的菌株表基因保持完整，这种整合产生的菌株表型为型为Mut+；另一种是双位点置换，含；另一种是双位点置换，含 5AOX1 启动启动子、外源基因和转录终止区的表达单元将染色体上子、外源基因和转录终止区的表达单元将染色体上的的 AOX1 基因置换下来，导致基因置换下来，导致
15、 AOX1 基因的缺失，基因的缺失，因而只能依靠弱转录的因而只能依靠弱转录的 AOX2 基因，所以利用甲醇基因，所以利用甲醇速度慢，由此产生的菌株表型为速度慢，由此产生的菌株表型为Muts。转化子表型的鉴定转化子表型的鉴定 基于此原理，我们对转化子进行了表型基于此原理，我们对转化子进行了表型鉴定，方法是以鉴定，方法是以5AOX1/3AOX1作为引物，作为引物，酵母基因组作为模板进行酵母基因组作为模板进行 PCR 扩增。如果是扩增。如果是 Mut+整合，可见两条带，一条与目的基因相整合，可见两条带，一条与目的基因相关，另一条为关，另一条为 AOX1 基因（大小约为基因（大小约为2.2 kb），如
16、果是），如果是Muts整合，只有与目的基因相关整合，只有与目的基因相关的一条带。的一条带。重组酵母菌表达重组酵母菌表达培养基：培养基：需要需要BMGY/BMMY(缓冲复合甘油或缓冲复合甲醇培养缓冲复合甘油或缓冲复合甲醇培养基基)BMG/BMM(缓冲最小甘油或缓冲最小甲醇培养基缓冲最小甘油或缓冲最小甲醇培养基)MGY/MM(最小甘油或最小甲醇培养基最小甘油或最小甲醇培养基)进行表达。进行表达。BMG,BMM,BMGY,BMMY用于分泌蛋白表达，特别是用于分泌蛋白表达，特别是当当PH对蛋白活性比较重要时。它们是缓冲培养基，这与对蛋白活性比较重要时。它们是缓冲培养基，这与MGY、MM不同。这四种培养基用磷酸盐缓冲，不同。这四种培养基用磷酸盐缓冲，PH值在一值在一个较大的范围内，可用于蛋白优化表达。酵母浸出物及蛋白个较大的范围内，可用于蛋白优化表达。酵母浸出物及蛋白胨作为胨作为“混合饲料混合饲料”，使生长更好并可积累大量表达产物。，使生长更好并可积累大量表达产物。重组酵母菌表达重组酵母菌表达蛋白酶：蛋白酶：有些蛋白特别易受在中性有些蛋白特别易受在中性PH值时有很好活性的值时有很好活性的蛋白酶的
