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1、细胞治疗在遗传性肺泡蛋白沉积症中的研究进展2023摘要遗传性肺泡蛋白沉积症(hPAP)是一种罕见的间质性肺疾病，由CSF2RA或CSF2RB突变引起，其特征为肺泡巨噬细胞功能失衡引起表面活性物质沉积。全肺灌洗治疗可有效缓解症状，但具有一定风险。细胞治疗是一种新型治疗方法，已在hPAP治疗中取得进展，为hPAP的治疗提供了新的治疗策略。肺泡蛋白沉积症(pulmonaryalveolarproteinosis,PAP)是一种罕见的间质性疾病1L该病发病率约7/1000000,其特征是不同原因引起的肺泡巨噬细胞功能异常，导致肺泡表面活性物质(surfactant,SF)在肺内大量沉积,引起气体交换障
2、碍，出现咳嗽、呼吸困难等症状。根据已知的发病机制，可分为原发性PAP、继发性PAP和先天性PAPo原发性PAP是目前发病率最高的PAP类型，其进一步分为以自身粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)抗体增多为特征的自身免疫性PAP(autoimmunePAPZaPAPW口以编召马GM-CSF受体CSF2RA或CSF2RB突变为特征的遗传性PAP(hereditaryPAP,hPAP)20针对不同类型的PAP患者，目前主要的治疗方案包括全肺灌洗(wholelungIavage,WLL)和GM-CSF治疗等。WLL疗效较为确切,可适用于所有PAP类型,但患者需全身麻醉插管，并且有发生术后并发症
3、的风险3;GM-CSF主要用于aPAP患者,但国内目前以aPAP为适应证的GM-CSF药物较少4,5o近些年，利妥昔单抗治疗、血浆置换治疗和调脂治疗等方法也在进行临床评价，但样本量较小6L肺移植也是治疗PAP的手段之一，主要针对PAP伴广泛纤维化和肺动脉高压的患者,但是肺移植风险和成本均较高。因此，目前PAP的治疗尚无安全、有效的治疗方案，探索新的治疗策略意义重大。细胞治疗是将不同的功能细胞输入患者体内，执行相关细胞功能，或调控局部微环境，促进内源性再生，达到改善或重建细胞或组织功能的一种疗法。目前，诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcell,iPSC骨髓或脐血来源干
4、细胞和（肺泡）巨噬细胞移植治疗在hPAP中的应用取得了进展7,本文就细胞治疗在hPAP的临床前研究及临床研究进行综述.一、细胞治疗hPAP的理论依据GM-CSF信号在肺泡巨噬细胞分化、成熟和执行功能中起重要作用，其信号功能异常导致泡巨噬细胞清除蛋白质和磷脂的能力受损,从而引起SF肺内沉积。因此，如何改善功能缺陷的肺泡巨噬细胞是治疗PAP的核心目的。因此，可以通过替代或修复功能损伤的肺泡巨噬细胞，达到治疗PAP的目的.二、细胞治疗hPAP的临床前研究目前，研究较多的PAP类别是hPAP,其细胞治疗的核心是外源性补充具备正常功能的肺泡巨噬细胞。Csf2ra-和Csf2rb-小鼠是研究hPAP的重要
5、工具，通过敲除Csf2ra或Csf2rb使小鼠肺泡巨噬细胞受体的盗或B链表达异常，从而产生与hPAP患者相同的疾病表型8,90因此，用于治疗PAP的巨噬细胞可根据来源分为骨髓或脐血来源（干）细胞、（肺泡）巨噬细胞和iPS&并根据治疗方式不同，可分为骨髓移植（bonemarrowtransplantation,BMT）和肺内巨噬细胞移植（pulmonarymacrophagetransplantation,PMT）2种方法10,11,1201.骨髓或脐血来源（干）细胞：肺泡巨噬细胞最初被认为是来源于血液的单核细胞，迁移到肺泡内分化而成，而单核细胞群体来自骨髓内的髓系祖细胞13,14I虽然后来很多
6、研究重新定义了肺泡巨噬细胞的来源15,16,重建髓系造血更新肺泡巨噬细胞仍然是干细胞治疗hPAP的重要思路，并获得了成功。Murray课题组最先将BMT引入hPAP的治疗。Csf2ra-小鼠经放射清髓后，经静脉输注野生型小鼠（C57BL/6）的骨髓细胞。接受了野生型小鼠骨髓细胞移植的Csf2ra-小鼠肺泡腔内的沉积物较前明显减少，支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid,BALF）中蛋白含量也有所减少17O这项研究是在认识hPAP机制之后对其治疗的首次尝试，为之后的研究奠定了基础。MoritZ课题组利用BMT的思路，结合基因编辑技术，对该疗法进行了更为深入的探索。
7、用Y-反转录病毒将小鼠Csf2ra基因转入Csf2ra-小鼠的骨髓细胞，12周后，经过治疗的Csf2ra-小鼠肺泡腔内沉积的SF明显减少。但是该构建方法转染率较低，仅10%20%1802018年，该课题组进一步使用第三代慢病毒载体(self-inactivatinglentiviralvector,SIN)将小鼠Csf2ra基因转入Csf2ra-/-小鼠骨髓来源的谱系阴性细胞(lineage-negativehematopoieticstemandprogenitorcells,Iin-HSPC1Csf2ra-小鼠经放射清髓后，接受改造后的Iin-HSPC静脉输注治疗。经过2次移植，肺泡腔内的
8、巨噬细胞表型接近于野生型小鼠(C57BL/6)肺泡巨噬细胞表型。小鼠BALF浑浊度和蛋白总量、BALF内GM-CSF和巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactor,M-CSF)浓度、胸部CT及病理均有好转，连续移植可使小鼠获得长达9个月的缓解期19。这种结合基因工程的造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation,HSCT)可以使术后可免于接受免疫抑制的相关处理，减少感染风险。RichardA.Flavell课题组通过在严重免疫缺陷小鼠(II2rgKOmice)内插入人源IL-3/GM-CSF基因片段构建了
9、人源化PAP小鼠模型huPAP1然后通过对huPAP新生鼠行肝内注射人脐带血来源的CD34+细胞。移植812周后，肺泡内出现人源的CD68+的巨噬细胞，并且沉积的SF明显减少，BALF内的蛋白含量也有所降低20O这种huPAP小鼠模型在后续的研究中起到了重要作用。2.(肺泡)巨噬细胞：随着新技术的出现，人们对肺泡巨噬细胞来源的认识更为深刻，逐渐证实肺泡巨噬细胞可在肺内稳态下自我更新，而三弹一依靠单核-巨噬系统；并且高度依赖肺泡内微环境，这为PMT提供了理论基础21ohPAP患者或小鼠由于肺泡巨噬细胞受体缺陷，不能接受GM-CSF刺激，从而产生了一个高浓度GM-CSF的环境，这也为移植的肺泡巨噬
10、细胞的发育和功能提供支持。因此，PMT成为hPAP治疗的新思路。Tmpnell课题组提取C57BL/6小鼠的原代巨噬细胞(bonemarrow-derivedmacrophage,BMDM)通过PMT完成了对Csf2rb-小鼠的治疗口0L移植1次后可在肺内存在1年，小鼠肺内的蛋白沉积量、BALF浑浊度以及肺泡巨噬细胞对GM-CSF的反应均得以改善。移植肺内的BMDM(CDlIbHiSigIecFLow)在肺泡微环境作用下逐渐转变为肺泡巨噬细胞(CDlIbLowSigIecFHi)表型。这项研究从细胞生产到移植过程对PMT进行了系统的实验，使小鼠不需要经过HSCT预处理和术后的免疫抑制，保持了小
11、鼠在移植后的免疫力，使移植过程更为安全。之后，该课题组继续利用Csf2ra-小鼠验证了该方法，同样取得了较好的疗效221Hansen课题组从C57BL/6小鼠骨髓中分离CD45.1+细胞,在体外经M-CSF作用形成BMDMo通过PMT将BMDM移植到Csf2ra-小鼠体内。经治疗9个月后，Csf2ra-小鼠的BALF浑浊度、BALF蛋白总量、胸部CT和呼气末暂停时间均有好转。之后继续利用huPAP模型，将健康人CD34+细胞来源的巨噬细胞(含有约35%的CD34+细胞)经PMT移植到huPAP小鼠当中，治疗后的小鼠在BALF和胸部CT方面均得到改善23tt除了BMDM,MartinPoSt课题
12、组利用小鼠胚胎多能干细胞(PSe：),制备出了PSC来源的Myb-肺泡样巨噬细胞，其表型比骨髓来源的巨噬细胞更贴近于正常野生型的肺泡巨噬细胞，并且其吞噬病原体和凋亡细胞的能力也优于BMDM24L随着人类肺泡巨噬细胞的发育及iPSC的研究深入，这种肺泡巨噬细胞可能会成为细胞移植治疗PAP的工具之一（I3.诱导性多能干细胞（iPSC）:iPSC自问世以来，一直是干细胞领域研究的热点。其通过体细胞重编程（Oct34xSoX2、Klf4和cMyc）的方法，使之从分化终末状态的细胞重新回到胚胎干细胞，并通过有针对性的诱导使之成为新的有功能的细胞。iPSC不存在像胚胎干细胞一样的伦理学问题,重新诱导后也没
13、有异体移植排异的难题。并且理论上可以源源不断的从患者体内获得细胞完成iPSC的制备25,261因此，科学家们也尝试利用iPSC生成有功能的肺泡巨噬细胞用于治疗hPAPMoritz课题组和Tr叩nell课题组分别利用hPAP患者的骨髓CD34+细胞和外周血单个核细胞（PBMC）构建了iPSCo验证iPSC的多能性后，通过M-CSF等细胞因子诱导形成巨噬细胞（iPS-M入然后通过慢病毒使iPS-M表达CSF2RA蛋白，经过IL-6分泌实验、吞噬实验和蛋白印迹等实验，证实了使之成为具备正常功能的巨噬细胞27,2801.achmann课题组从正常C57BL/6小鼠骨髓中分离出CD45.1+细胞，利用慢
14、病毒载体转入构建iPSC,再诱导分化成巨噬细胞（CD45.1+iPSC-M）,并验证了其相关功能。同时，也从Csf2ra-小鼠骨髓内分离出了骨髓来源Iin-细胞，重编程形成iPSC后，诱导分化成肺泡巨噬细胞290之后，经气道单次移植iPSC-M,于肺内其表型过渡为肺泡巨噬细胞表型，并且移植组小鼠肺内SF的沉积较未移植组明显好转300这些实验证明了iPSC-M移植对hPAP的疗效，同时也说明了肺内微环境对肺泡巨噬细胞表型的影响。Hansen课题组从健康人体内获取细胞后利用慢病毒载体构建了hiPSC,以hIL3hM-CSF刺激后形成iPSC-Mo体外验证其表型和吞噬能力后,将iPSC-M细胞通过P
15、MT移植入huPAP。治疗2个月后BALF浑浊度、SF含量及病理均获得改善。huPAP小鼠BALF内出现人源CD45+细胞，移植后的iPSC-M表型出现人的肺泡巨噬细胞表型（CDlIbIowCDU-）31,321三、细胞治疗hPAP临床研究基于以上临床前研究，目前有4例hPAP患者接受了细胞治疗，多为反复多次接受WLL治疗的患者。第1例接受HSCT治疗的hPAP患者为4岁女性患儿，患有Turner综合征，在3岁时确诊PAP,基因测序显示CSF2RA外显子5-13缺失，该患者于接受HSCT后4周死亡，死因是肺部感染，未能进行治疗后PAP长期疗效两介330第2例接受HSCT治疗的hPAP患者为6.
16、3岁女性患儿，其在2.6岁时确诊hPAP（母亲来源的X染色体CSF2RA和CRLF2缺失；CSF2RA等位基因缺失）。其HSCT使用的造血干细胞由1名男性非亲缘供者提供（10/10HLA位点相合），治疗齐IJ量为121.6x106个CD34+细胞。移植后15dBALF中供体嵌合率达到94%,全血嵌合率达到100%,其BALF内泡沫样细胞数目明显减少。之后患者的呼吸状况逐渐好转，需氧量也在减少。第66天出现急性GVHD（皮肤II度，肠道IV度），后续用六联的免疫抑制方案控制。移植后6个月，患者的CT表现和肺功能正常，未再接受WLL治疗34L第3例患者为18岁男性，其在4岁时确诊hPAP(CSF2RA基因外显子2-13同源性缺失，父母均不携带该突变I其父亲作为供者(10/10HLA位点相合)为患者了造血干细
