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1、干细胞治疗重症肝炎肝硬化干细胞治疗重症肝炎肝硬化 药物治疗药物治疗 无特效药无特效药 成体干细胞的生物学特性为开展细胞治成体干细胞的生物学特性为开展细胞治疗奠定了基础疗奠定了基础1 1、长期存活、不断的自我繁殖、长期存活、不断的自我繁殖2 2、可以跨系、跨胚层分化、可以跨系、跨胚层分化,具有强大的可塑性具有强大的可塑性3 3、化学趋向性、化学趋向性成体干细胞在临床细胞治疗中的运用成体干细胞在临床细胞治疗中的运用干细胞治疗肝炎肝硬化解决什么问题干细胞治疗肝炎肝硬化解决什么问题？干细胞移植治疗肝炎、肝硬化是指医生可以用干细胞移植治疗肝炎、肝硬化是指医生可以用结构和功能正常的细胞作为结构和功能正常的
2、细胞作为“药物药物”输给患者，输给患者，以以修复受损硬化的肝组织，改善肝功能，修复受损硬化的肝组织，改善肝功能，达到达到改善病人一般状况的目的，起到临床治疗疾病改善病人一般状况的目的，起到临床治疗疾病作用。作用。选择哪种选择哪种干干细胞？自体骨髓来源的干细胞。异基因骨髓来源的干细胞，由捐赠者提供。异基因脐带血脐带血来源的干细胞。骨髓、脐带血、外周血的比较骨髓、脐带血、外周血的比较脐带血 骨髓 外周血 粒单系集落生成细胞集落数量(CFV-GM)486 1124 122 培养集落出现时间 4-5天 4-6天 7天以上 集落构成特点 单核巨噬细胞为主 粒单混合 嗜酸性粒细胞为主 对CSF的反应 敏感
3、 中度敏感 中度敏感 CD34+57%16%9.6%7.8%9%4.9%CD38-24%7.3%4.6%3.2%9.1%4%CFV-GM粒单系集落生成细胞 CSF集落刺激因子骨髓中的干细胞比外周血的干细胞原始。脐带血比骨髓更为原始。脐带血的干细胞自我繁殖能力最强。繁殖速度最快。骨髓次之。脐带血中干细胞的比率最大，骨髓次之。外周血中的干细胞更接近终端细胞或叫祖细胞或前体细胞。HLAHLA配型的探讨配型的探讨1、异体骨髓移植必须做HLA配型。2个位点不合和3个位点不 合成功移植的报导都很多。2、异体骨髓做局部细胞治疗时，有不做HLA配型，也有作的 报道。3、脐带血干细胞在作移植时，也是必须做HLA
4、配型。HLA半 相合移植成功率远高于骨髓。原因：脐带血干细胞比骨髓更原始。脐带血干细胞表面抗原性远比骨髓弱。4、脐带血干细胞在用做细胞治疗时可以忽略HLA配型问题，就如同临床上输血一样，不用HLA配型。脐带血干细胞的表面抗原性很弱，弱到不被 受体的免疫系统识别。用于细胞治疗的脐血干细胞不替代原有的 组织器官，原有的组织器官还在起作用。骨髓采集 骨髓采集多选择髂后上脊 选择选择多孔采髓针 采集量视需要而确定 一般采集200ml 保存在含有橘缘酸钠的血袋中，周转、传递。血袋必须用塑封机封好骨髓、脐带血骨髓、脐带血干细胞筛选方法？干细胞筛选方法？免疫磁珠分选法 流式细胞仪分选法 单抗贴壁铺展法 外周
5、血细胞分选仪 淋巴细胞分离液免疫磁珠分选法3、单抗贴壁铺展法4、脐带血细胞分选仪5、淋巴细胞分离液各种分离提取方法比较各种分离提取方法比较负负收集混合法收集混合法流式流式细细胞胞仪仪法法磁珠法磁珠法外周血外周血细细胞分胞分选仪选仪法法Ficll 法法分离的分离的原理原理选择选择性的除去性的除去红细红细胞、血小胞、血小板、全部的血板、全部的血浆浆物物质质、成熟、成熟的白的白细细胞、淋巴胞、淋巴细细胞。保留胞。保留Lin-细细胞胞除去所有未除去所有未标记标记的的细细胞胞除去所有未除去所有未标记标记的的细细胞胞除去大部分除去大部分红细红细胞、血小板。胞、血小板。除去密度除去密度1.077的有形成的有
6、形成分分靶靶细细胞表胞表面面标记标记物物无无有有有有无无无无收集的靶收集的靶细细胞种胞种类类能收集所有能收集所有Lin-干干细细胞胞/祖祖细细胞胞选择选择性的收集性的收集CD34、CD133、C-Kit、Sca-1等等选择选择性的收集性的收集CD34、CD133、C-Kit、Sca-1等等95%是中性粒是中性粒细细胞。干胞。干细细胞胞/祖祖细细胞数量很少，胞数量很少，还还残留一些淋残留一些淋巴巴细细胞、胞、红细红细胞胞保留所有的保留所有的单单核白核白细细胞、胞、淋巴淋巴细细胞、干胞、干细细胞、祖胞、祖细细胞胞最小体最小体积积0.5ml1.0ml10ml50-100ml1.0ml动员剂动员剂不需
7、要不需要不需要不需要必必须须动员剂动员剂使用使用风险风险很大很大WBC可以达到可以达到5-10万万血血浆浆残留残留无无有有有有有有无无分分选对选对象象骨髓、骨髓、脐带脐带血血骨髓、骨髓、脐带脐带血、外周血血、外周血骨髓、骨髓、脐带脐带血、外周血血、外周血外周血外周血骨髓、骨髓、脐带脐带血、外周血血、外周血细细胞胞回收率回收率85%依据抗体含量决定，抗体含量依据抗体含量决定，抗体含量足，回收率可达到足，回收率可达到99%依据抗体含量决定，抗体含量依据抗体含量决定，抗体含量足，回收率可达到足，回收率可达到99%70%60%细细胞胞存活率存活率98%90%95%98%98%投投资资成本成本10万元万
8、元60万元万元10万元万元30万元万元10万元万元每分离一每分离一份份标标本的本的成本成本7000-10000元左右元左右视视抗体种抗体种类类而定至少而定至少7000元元视视抗体种抗体种类类而定至少而定至少7000元元3000元左右元左右1000元左右元左右骨髓、脐带血有核细胞体外分离试剂盒骨髓、脐带血有核细胞体外分离试剂盒介绍介绍 试剂盒是专门用于临床分离骨髓和脐带血中的有核细胞的，一个试剂盒设计分离200ml骨髓或200ml脐带血。分离方法简单。正常按说明操作能有效全部除去红细胞、血小板、及去全部血浆物质，只回收有核细胞，分离时如操作熟练，有核细胞回收率85%以上。细胞存活率96%以上，不
9、损伤干细胞，干细胞表面无任何标记物，不改变干细胞的生物活性。分离纯化后的干细胞/祖细胞建议立即使用，不能立即使用则必须保存-196度。能有效保留全部的干细胞、祖细胞。能有效保留全部的干细胞、祖细胞。细胞表面没有任何标记物，不改变干细胞生物活性。细胞表面没有任何标记物，不改变干细胞生物活性。分离程序合理，没有明显污染过程、分离成本低，分离程序合理，没有明显污染过程、分离成本低，细胞表面有抗体标记，而且不是所有人用同一管道分离无污染过程。细胞表面有抗体标记，而且不是所有人用同一管道分离无污染过程。试剂盒设计符合干细胞生物学的要求，试剂盒要求新鲜骨髓和新鲜脐带试剂盒设计符合干细胞生物学的要求，试剂盒
10、要求新鲜骨髓和新鲜脐带血，从采集到分离使用不许超过血，从采集到分离使用不许超过1212小时。以保证干细胞的生物学活性小时。以保证干细胞的生物学活性不发生改变。不发生改变。通常情况下成体干细胞离开人体环境后，会很快分化为与其组织来源一通常情况下成体干细胞离开人体环境后，会很快分化为与其组织来源一致的组织细胞。致的组织细胞。投资成本低廉。投资成本低廉。不要求特殊设备。不要求特殊设备。操作简单。操作简单。干细胞治疗肝炎肝硬化的治疗干细胞治疗肝炎肝硬化的治疗途径？途径？肝动脉途径肝动脉途径 门静脉途径 经皮肤穿刺将经皮肤穿刺将干细胞直接注射到肝脏干细胞直接注射到肝脏。静脉输入法静脉输入法，该方法主要用
11、于一般情况很差，该方法主要用于一般情况很差，不能耐受介入或经腹部穿刺直接注射的，而且不能耐受介入或经腹部穿刺直接注射的，而且是采用是采用异基因脐带血来源的干细胞。病例介绍 男性，69岁，因“进行性腹胀1月”收入院。入院时患者情绪差，全身烦热，烦躁不安，手心、脚心均觉烦热明显，不能久卧及睡眠，每日睡眠不足1小时。入院查体：生命征平稳，一般情况较差，慢性病容，皮肤粘膜黄染，烦躁不安，情绪差，应答可。心肺正常。腹部膨隆，腹围增加，紧张力稍高。触软，无压痛、反跳痛，肝脾肋下未触及，液波震颤及移动性浊音阳性，肠鸣音正常。外院查肝功能“ALT 112U/L,AST 134U/L,ALB 28g/L,TBI
12、L 90umol/L,DBIL 42umol/L”,血常规报“血小板 82*109/L”。患者既往有长期大量药物及保健品进食史。病例介绍 入院后检查各项病毒性肝炎均阴性，肝脏CT检查报“慢性肝病损害，符合药物性肝损伤图像”，PET-CT排除腹部肿瘤及转移。入院后诊断 1.药物性肝损伤 2.肝硬化（失代偿期）3.脾功能亢进 4.腹水。病例介绍 入院后经利尿、补充白蛋白等治疗后，患者腹水有所好转，但因肝功能差，其余症状改善差。为积极救治患者，行脐血干细胞肝内治疗术，将新生儿脐血提出的高活性干细胞注入肝脏动脉中，干细胞在患者肝脏内定值生长脐血干细胞分离准备材料脐血干细胞分离准备材料 无菌切开包和换药
13、碗（带剪刀）无菌切开包和换药碗（带剪刀）无菌衣帽口罩鞋套无菌衣帽口罩鞋套 移液枪（电池，反渗透）移液枪（电池，反渗透）一次性注射器（一次性注射器（2020毫升毫升1010个，个，5050毫升毫升2 2个，个，1 1毫毫升升3 3个）个）记号笔，酒精灯，打火机，记号笔，酒精灯，打火机，消毒棉球，酒精（消毒棉球，酒精（75%75%）1 1桶，镊子桶，镊子2 2把把 冰壶冰壶再用 A 液 30 ml 将沉淀细胞混均离心后去掉上清液收集沉淀物（有核细胞）10ml 10ml 10ml30ml分离、纯化后的干细胞检测分离、纯化后的干细胞检测1、细胞存活率检测：使用溴芬蓝染色法。2、所提取的细胞总数计算 细
14、胞计数板计数法 血球计数仪计数法3、干细胞的定性测定 培养扩增法 流式细胞仪检测法，用已知抗原标记后测定。CD34+、CD117+、CD133+、C-kit+、Sca-1+干细胞形态学及表面抗原性 干细胞是不均一的细胞群体，缺乏直接的形态学特征干细胞是不均一的细胞群体，缺乏直接的形态学特征。目前对它的研究主要是干细胞表面抗原性的研究，而且研究和报道最多的是造血干细胞。干细胞的表面抗原按其发现的早晚的顺序命名、排列，现在已经有一百多种。CD34 CD38 SCa-1 C-Kit CD133 Lin CD117 CD59 CD41 CD13 CD14 CD71 CD61 CD90 CD10 CD5 CD107 CD31 CD11 CD2 CD106 CD120 CD25 CD7 CD16 CD15 CD14 CD63 CD20 CD124 CD117 CD21 CD22 CD19 CD45 Thy-1 CD3 CD4 CD7 CD8 CD11 CD11B CD29 CD90 CD65 等等。这些干细胞的表面抗原及其单克隆抗体在识别、分离、纯化以及鉴别干细胞/祖细胞方面提供了非常重要的帮助。病例介绍 经治疗后随访患者1个月，患者腹水基本消退，静脉药物已经停用，肝功能恢复正常，睡眠基本正常，全身烦热等症状消失，饮食正常。
