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1、实验实验 23琼脂糖凝胶电泳法测定琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶实验目的实验目的 v掌握：掌握：电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶的基本电泳法测定血清乳酸脱氢酶同工酶的基本原理。原理。v熟悉：熟悉：电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的的操电泳法分离血清乳酸脱氢酶同工酶的的操作过程、注意事项及对疾病诊断的临床意义。作过程、注意事项及对疾病诊断的临床意义。v了解：了解：琼脂糖凝胶电泳的临床应用。琼脂糖凝胶电泳的临床应用。实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢
2、酶同工酶乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同，乳酸脱氢酶同工酶的一级结构和等电点不同，在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然后利用酶的催化反应进行显色：后利用酶的催化反应进行显色：HNADH9.8pH8.8 LDNAD丙丙酮酮酸酸乳乳酸酸L L实验原理实验原理 NADPMSH2PMS2HNADHHINTHPMS2INT2PMSH实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶1巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度，离子强度0.075）20.082mol/L巴比妥巴比妥-盐酸缓冲液（盐酸缓冲液
3、（pH 8.2）310mmol/L乙二胺四乙酸二钠乙二胺四乙酸二钠 45g/L缓冲琼脂糖凝胶缓冲琼脂糖凝胶 58g/L缓冲琼脂糖凝胶缓冲琼脂糖凝胶 6显色试剂显色试剂7固定漂洗液固定漂洗液 试剂与器材试剂与器材 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶1制备琼脂糖凝胶玻片制备琼脂糖凝胶玻片 2加样加样 用微量加样器加约用微量加样器加约40l血清于槽内。血清于槽内。3电泳电泳 电压电压75V100V，电泳，电泳30min40min。4显色显色 5固定和漂洗固定和漂洗操作步骤操作步骤 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测
4、定乳酸脱氢酶同工酶1目视观察目视观察 在碱性介质中，在碱性介质中，LD同工酶电泳条带同工酶电泳条带由正极到负极依次为：由正极到负极依次为：LD1、LD2、LD3、LD4和和LD5。按各区带呈色的深浅，比较。按各区带呈色的深浅，比较LD各同工酶各同工酶区带呈色强度的关系。区带呈色强度的关系。2光密度计扫描光密度计扫描 用光密度计在用光密度计在570nm波长下扫波长下扫描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。结果观察结果观察 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶3在不具备光密度仪扫描条件下，如果需要进行在不具备光
5、密度仪扫描条件下，如果需要进行定量定量，可将各区带切开，分别装入试管中，加入可将各区带切开，分别装入试管中，加入400 g/L尿尿素素 4ml，于沸水浴中加温，于沸水浴中加温5 min10min，取出冷却，取出冷却后以后以570nm波长比色。波长比色。空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用空白管则取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方法处理。上述相同的方法处理。比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。结果观察结果观察 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶吸光度总和：吸光度总和：A总总A1+
6、A2+A3+A4+A5，式中式中A1、A2、A3、A4、A5为各同工酶区带的吸光度为各同工酶区带的吸光度各同工酶百分率各同工酶百分率(%)(%)为：为：(x=1，2，3，4，5)100LD总）（AA%xx计算计算 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶健康成年人血清中健康成年人血清中LD同工酶百分比同工酶百分比有下述规律：有下述规律：LD2LD1LD3LD4LD5。参考范围参考范围 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶1.LD同工酶电泳分析在临床上常用于急性心肌梗死的同工酶电泳分析在临床上常用于急
7、性心肌梗死的诊断，在急性心肌梗死时诊断，在急性心肌梗死时LD1与与LD2活性均升高，但活性均升高，但LD1升高更早、更明显，导致升高更早、更明显，导致LD1/LD2比值增大比值增大。2.溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病肥大性肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患者血清毒性心肌炎患者血清LD1和和LD2的活性也可增高的活性也可增高。临床意义临床意义 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶3.肝炎、急性肝细胞损伤时肝炎、急性肝细胞损伤时LD
8、5增高。急性肺损伤、增高。急性肺损伤、白血病、胶原病、心包炎以及病毒感染时白血病、胶原病、心包炎以及病毒感染时LD2和和LD3增高增高。4.胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶同工酶均可升高，但均可升高，但以以LD3增高最为显著增高最为显著。骨骼肌损伤。骨骼肌损伤时时LD4和和LD5增高增高。临床意义临床意义 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶1严禁溶血。严禁溶血。2LD4与与LD5（尤其是（尤其是LD5）对热很敏感，因此底）对热很敏感，因此底物物-显色液的温度不能超过显色液的温度不能超过50，否则易
9、使，否则易使LD5等等变性失活。变性失活。3LD4和和LD5对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜标本测定。如果需要，血清应放置于标本测定。如果需要，血清应放置于25条件下条件下保存，一般可保存保存，一般可保存2d3d。4PMS对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则对光敏感，故底物显色液需避光保存，否则显色后凝胶板背景颜色较深。显色后凝胶板背景颜色较深。注意事项注意事项实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶v操作简便、重复性好、标本用量少操作简便、重复性好、标本用量少。v明显的溶血会导致假阳性。明显的溶血会导致假阳性。评价评价 实验实验23 琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶1LD同工酶测定时为什么要严禁溶血？为何测定同工酶测定时为什么要严禁溶血？为何测定LD的血清标本不能冰冻或冷藏？的血清标本不能冰冻或冷藏？2LD同工酶测定对疾病诊断的临床意义为何优于同工酶测定对疾病诊断的临床意义为何优于LD总活性测定？总活性测定？3LD同工酶琼脂糖电泳测定的原理是什么？在电同工酶琼脂糖电泳测定的原理是什么？在电泳中应注意哪些事项？泳中应注意哪些事项？思考题思考题
