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1、内镜黏膜下剥离术/内镜黏膜切除术标本常规制片专家共识2023摘要内镜黏膜下剥离术(endoscopicsubmucosaldissectionzESD)/内镜黏膜切除术(endoscopicmucosalresection,EMR)作为内镜下治疗消化道早期癌的微创手术，其技术日趋发展成熟，多项国际指南和共识均推荐ESD/EMR作为消化道早期癌及其前驱病变的首选治疗方式,ESD/EMR标本的诊断结果影响后续治疗方式的选择，因此ESD/EMR的病理学评估相对于传统外科手术标本应更为严格及精准。在取材制片的过程中存在诸多因素影响ESD/EMR标本病理诊断的准确性。本共识规范了ESD/EMR标本处理以
2、及常规制片的方法，旨在提高病理诊断的准确性，为临床进一步诊疗提供可靠、合理的病理依据。正文内镜黏膜下剥离术(endoscopicsubmucosaldissection,ESD)和内镜黏膜切除术(endoscopicmucosalresection,EMR)是消化道早期肿瘤治疗的重要方法。由于ESD/EMR不进行淋巴结清扫且切除深度仅限于黏膜下层，对于一些有淋巴结转移风险的消化道早期肿瘤患者,ESD/EMR病理学评估后可能需进一步治疗，因此ESD/EMR的病理学评估相对于外科手术标本应更为严格和精准。ESD/EMR病理学评估包括标本水平及垂直切缘状态、组织学类型、浸润深度、是否浸润淋巴管和血管
3、、肿瘤生长方式、溃疡瘢痕的形成、肿瘤芽等信息。其中切缘的评估是为了判断肿瘤是否完全切除；组织学类型、浸润淋巴管和血管、浸润深度、溃疡瘢痕、肿瘤生长方式、肿瘤芽等评估是为了推测淋巴结转移风险。而标本处理、制片过程的规范化及标准化影响病理评估结果的准确性。标本的伸展固定主要由临床医师完成，标本的拍照、取材、脱水、包埋、切片、染色是由病理医师和病理技师共同完成。一标本伸展固定由于黏膜存在张力，放入固定液中容易收缩，为了保持ESD/EMR标本的平整性和完整性，真实还原病变离体前的状态和相对位置，避免黏膜肌层回缩、黏膜水平切缘内卷。内镜医师在组织离体后，把整块黏膜标本平展，黏膜面向上，用直径较小、在液体
4、中不易生锈的细针在标本边缘非肿瘤的黏膜上，将整个黏膜固定于固定板上，确保边缘黏膜上皮和黏膜肌同时被细针垂直穿过。有以下注意事项：（1）当病变距离切缘很近或黏膜边缘回缩明显时，需在剥离面侧滴加解痉药物，再展平标本；（2）细针须与切缘保持适当的距离，不能钉在切缘处的黏膜上，以避免拔针过程中对切缘的损坏；（3）细针不能钉在病变黏膜上，避免拔针后病变组织缺损；（4）病变距切缘很近或可疑切缘阳性处，不要在此处钉入细针，防止拔细针的撕扯，造成切缘假阳性（图1）。标本伸展固定后临床医师须在标本周围标记其在体内的相对位置，如口侧、肛侧、前壁、后壁等。欧94&CC01jIUI1QLnOOQO690。UoOO图1
5、病变距切缘很近或可疑切缘阳性处（T）,不钉细针，防止拔细针的撕扯，造成切缘假阳性图2取材刀未切断（显示刀痕）的图片可以当作复原图使用，在其刀痕处进行病变标记（实线的组织面是显微镜下观察的切片组织面，虚线的组织面是蜡块包埋面的反面）图3A食管内镜黏膜下剥离术（ESD）标本碘染色前图3B食管ESD标本碘染色后，棕色着色部分为正常食管黏膜，未着色部分为病变黏膜图4扁平病变的取材方式分为病变距离某点切缘较近（4A）和病变距四周切缘有一定距离（4B）两种情况，病变距离某点切缘较近时，首先确定病变距切缘最近处的切线，垂直于切线，间隔23mm全部取材;病变距四周切缘有一定距离时，不需要寻找切线，直接间隔23
6、mm显示刀痕拍照后全部取材图5在标本的一侧用鲜艳的标记染色液进行标记图6A宽蒂（直径2mm）的息肉标本，距蒂中心错开1mm处垂直于蒂部切缘，间隔2mm将息肉标本全部取材图6B窄蒂（直径2mm）的息肉标本，垂直于蒂部切缘，间隔2mm将息肉标本全部取材，使蒂部作为一个单独的蜡块图6C无蒂息肉，以切缘基底部为中心，间隔2mm向左、右将息肉标本全部取材图6D镜像包埋，带蒂息肉组织切开后，均包埋切开面标本伸展固定后黏膜面朝下浸泡于中性缓冲甲醛固定液。若固定板为泡沫板，须于泡沫板上放置纱布，确保整个组织完全浸没于固定液。室温下固定时间6-48h为宜。明显带蒂的标本不需要伸展固定,直接放入固定液；亚蒂或无蒂
7、的标本，应使用切缘标记液（如墨汁等）对离断面进行染色标记后再放入固定液。在病理申请单上应注明标本大小、肿瘤大小、肿瘤的肉眼分型；有蒂病变需注明蒂部的长短。注：分块切除标本的伸展固定最好由进行ESD/EMR的内镜医师或内镜医师的助手完成，因为他们更清楚黏膜之间的关系及其在体内的位置。二、标本拍照、取材标本拍照对于制作复原图十分重要。需对拔钉前后、取材刀未切断（显示刀痕）的标本分别进行拍照。取材刀未切断（显示刀痕）的图片可以当作复原图使用，在其刀痕处进行标记（图2）,目的是使显微镜下病变区域与标本病灶区域实现点对点对应。拍照前根据临床医师提供的口侧、肛侧标记对标本进行摆放，一般情况下，面对标本口侧
8、置于右侧，肛侧置于左侧。在适当位置加上刻度尺，刻度尺的高度尽量和标本的高度保持一致，拍摄标本的全貌，也可以根据需要拍摄病灶的近距图像。标本的测量内容包括：标本的长径和短径（长径mmX短径mm）,病变的长径和短径（长径mm*短径mm）,判断并记录大体分型。食管早期癌中平坦型病变多见，黏膜变化不明显。由于食管的鳞状上皮细胞发生癌变时胞质内糖原减少，碘染后相应部位会呈现淡染或不染现象，因此食管早期癌ESD/EMR标本处理及拍照前应先用碘染色以便观察病变与正常组织的交界、病变位置及与切缘之间的距离。碘液一般浓度为0.3%,不能超过0.5%,日常放在棕色瓶子里避光保存，使用前根据试剂浓度进行稀释。碘液染
9、色之前需用流动水对标本进行充分冲洗，目的是为了去除固定液，但不能将水柱直对标本。冲洗时间至少为30min,去除固定液的效果越好染色效果越好。比如冲洗时间为60min,使用0.15%的碘液染色即可。滴上染液后一般23min即可着色，若标本状态十分良好，染IOS左右即可着色。碘染色后会自动褪色，不需要二次冲洗。根据需求，褪色后可二次染色（图3）。取材的方式是由病理报告的内容决定的。扁平病变：如图4所示，（1）病变距离某点切缘较近时，首先确定病变距切缘最近处的切线,垂直于切线，间隔23mm全部取材，贯穿整个标本但不离断组织，显示刀痕，拍照之后在原刀痕处自标本一端开始按序离断组织；（2）病变离四周切缘
10、都有一定距离时，不需要寻找切线直接间隔23mm显示刀痕拍照后全部取材按序离断组织。为了后续包埋保持正确的方向，应在标本的一侧（没有明确规定左侧或者右侧科室内部统一即可）用鲜艳的标记染色液进行标记（图5）。息肉样病变：根据息肉病变的特点决定取材方式，蒂的中心部位通常为浸润最深处，也是切缘评价处。（1）带蒂息肉，若蒂直径2mm,考虑到石蜡包埋标本的粗切，应在距蒂中心1mm垂直于蒂切缘切开标本，再平行此切面，以2mm间隔全部取材;若蒂直径2mm,应垂直于蒂切缘间隔2mm将标本全部取材。需保证整个蒂部做成一个单独蜡块。（2）无蒂息肉，应仔细辨认黏膜的电灼切缘或临床标记点，将电凝变性发白部或临床标记点作
11、为寻找的重点目标，需保证此处做成一个单独蜡块。再平行此切面，以2mm间隔全部取材（图6）。包埋盒内放置海绵片/纱布/滤纸，根据包埋盒的宽度选择盒中放置的组织条数，一般为23条组织。将离断后的组织平移到包埋盒内，黏膜面朝上，颜料标记端统一朝向包埋盒标签侧或标签对侧（没有明确规定，科室内部统一即可），在组织上盖上海绵片/纱布/滤纸，盖上包埋盒底盖。放置海绵片/纱布/滤纸是为了防止脱水包埋过程中的组织条卷曲及移动。为更好保持ESD标本的组织结构完整性，对于长度大于常规包埋盒的标本，建议采用大蜡块大切片制作方法，可避免多张小切片拼接产生的结构误差。如果不能制作大蜡块及大切片时，取材医师需要根据组织及病
12、变范围大小，在病变组织适当位置垂直下刀离断组织，并在取材图上进行标注后交给包埋技师，使技师能够准确包埋。三、组织的脱水.包埋切片.染色ESD/EMR标本无论从组织大小、厚薄以及组织质地均与一般手术标本无异，组织处理包括取材后固定、脱水、透明、浸蜡均可参照常规手术标本处理程序。没有全自动组织脱水机的单位可采用手工脱水方式进行脱水，也能得到理想的脱水效果。实验室应建立统一ESD/EMR包埋流程（图7）,包埋面、组织条方向应与取材医师意图一致。如有多条组织包在一个蜡块中时，确保颜料标记端、黏膜面在相同方向，且多条组织包埋在同一水平面（紧贴包埋盒底部）。按照脱水盒中组织块顺序进行组织包埋，包埋时将组织
13、立埋（黏膜垂直于包埋盒底面），保证每个组织块向同一个方向90翻转，标本最后边缘一个组织块向相反方向90。翻转。先将包埋盒注入石蜡，手持微倾置于冷台上，将组织块依次放入包埋盒，同时调整包埋盒角度，使包埋盒底部石蜡的凝固与组织块的放入基本同步，然后轻轻按压，使所有组织条的包埋盒底部接触面位于同一水平面，以保证技师切片时多条组织同时被切到。最后放上脱水盒底盖，注满石蜡，待完全冷却分离蜡块和模具。由于包埋室室温差异致石蜡凝固速度不一致，多条组织包埋在蜡块的同一水平面非常考验技师的包埋技能。如果不能做到多条组织包埋在同一水平面，应该和取材医师沟通，一个脱水包埋盒放一条组织。同样包埋时将组织立埋（黏膜垂直
14、于包埋盒底面），保证每个组织块向同一个方向90。翻转，标本最后边缘一个组织块向相反方向90。翻转。息肉样标本包埋时尽可能使蒂部（离断面）朝向包埋盒的下方，镜像包埋（带蒂息肉组织切开后，蒂部组织均包埋切开面），其余组织以蒂部为中心，向中心方向翻转包埋。图7A轻轻揭去海绵，严禁海绵下组织条移位图7B用银子夹住组织条右侧一端使得组织条顺时针侧转90。图7C包埋模灌注适量石蜡，把组织条侧立于包埋模中间图7D包埋底盒盖住包埋模，再次灌注石蜡至合适平面图8A蜡块标签侧朝左用样本夹夹紧，粗修后用银子在标签侧蜡块空白处点两个孔做标记图8B蜡片摊于温水内，有标记为标签侧图8C将标记朝标签侧贴片图9A、9B胃ES
15、D标本HE切片全景、全层结构图，镜下呈现为上皮侧在上方，剥离面在下方的自上而下全层结构图9C、9D食管ESD标本HE切片全景、全层结构图，镜下呈现为上皮侧在上方，剥离面在下方的自上而下全层结构ESD/EMR组织蜡块切片方式、摊片水温与常规组织蜡块一致；组织切片应确保切面完整，无刀痕、无组织皱褶、无缺损等情况；捞片时注意切片组织方向与蜡块组织方向相同。且尽量使组织条平行于载玻片长轴，为了确保方向相同，可以在蜡块上标记点孔（图8）。ESD/EMR组织切片的染色与常规手术标本的组织切片染色相同。四.切片呈现及自检切片制作完成，技师必须对每张切片进行肉眼及镜下自检。所有ESD标本的切片在载玻片上肉眼观
16、应呈现：组织条平行于载玻片长轴，载玻片标签侧朝左状态下，组织上皮侧完整且朝向载玻片长轴下方，组织剥离面完整且朝向载玻片长轴上方，因镜像原因，在显微镜下观察时，可呈现为上皮侧在上方，剥离面在下方的自上而下全层结构（图9）。镜下自检，发现有刀痕、皱褶、空洞、切片不全，尤其是黏膜面不全，剥离面不全等现象的非优切片，需要进行重切重染处理。由于ESD/EMR技术是近年来新兴的肿瘤微创治疗技术，传统病理学取材制片规范中缺少相应的内容。本共识详细阐述ESD/EMR组织标本的预处理、标本的取材、脱水、包埋、切片、染色等技巧及注意事项，从实际出发，力求简捷，具有可操作性和指导性，为推进ESD/EMR标本的规范化、标准化切片制作奠定基础。
