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1、保健食品功能检验与评价方法（2023年版）缓解体力疲劳I .1实验项目II .1动物体重1.1.2 负重游泳实验1.1.3 血乳酸1.1.4 血清尿素1.1.5 肝糖原或肌糖原1.2 试验原则1.2.1 动物实验所列指标均为必做项目。1.2.2 实验前必须对同批受试样品进行违禁成分的检测。1.2.3 运动实验与生化指标检测相结合。1.3 结果判定负重游泳实验结果阳性，血乳酸、血清尿素、肝糖原/肌糖原三项生化指标中任二项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解体力疲劳的作用。缓解体力疲劳检验方法动物实验1负重游泳实验1.4 检验原理运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反应动物
2、运动疲劳的程度。1.5 仪器与器材游泳箱（大小约50cm50cm40cm）电子天平、铅皮。1.6 实验方法1.1.1 验动物推荐使用纯系小鼠，成年小鼠，体重18-22g01.1.2 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组,必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.1.3 实验步骤末次给予受试样品30min后（酒类样品测试当天可以不灌胃）将尾根部负荷5%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm,水温25C1.0C,记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。1.4 数据处理及
3、结果判定游泳时间为计量资料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算尸值，F值Foos,结论：各组均数间差异无显著性；尸值、凡a，P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。若受试样品组负重游泳时间明显长于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。1.5 注意事项1.5.1 每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多，否则互相挤靠，影响实验结果。1.5.2 水温对小鼠的游泳时间有明显的影响，因此要求
4、各组水温控制一致，每一批小鼠下水之前都应测量水温，水温以25C为宜，如果过低可能引起小鼠痉挛，影响实验结果，过高（30）则游泳时间太长不便于操作。1.5.3 铅皮缠绕松紧应适宜。1.5.4 观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动。如果小鼠漂浮在水面四肢不动，可用木棒在其附近搅动。1.5.5 不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异。因此受试样品组和对照组应采用同一批动物同时进行实验。2血清尿素测定全自动生化仪测定和二乙酰一后法任选一种。2.1 全自动生化仪测定：按有关仪器说明书和试剂盒操作。2.2 二乙酰一的法2.2.1 原理样品中尿素在氯化高铁一磷酸溶液中与二乙酰一后
5、和硫氨服共煮，形成一种红色的化合物DiaZine,其颜色的深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准管比较，可求出尿素的含量。2.2.2 仪器和试剂2.2.2.1 721分光光度计，IOmL带塞试管，ImL（或1.5mL）塑料离心管，电炉，锅，灌胃针头。2.2.2.2 尿素试剂盒（二乙酰一后法二乙酰一后应用液、氯化铁一磷酸应用液、尿素标准液（200mgL）2.2.23若无试剂盒，可自行配制试剂。试剂配制方法如下：lgL二乙酰一后溶液：取二乙酰一后LOg,氨基硫腺（thiosemicarbazide）0.2g,氯化钠4.5g,溶于蒸储水并加至100OmLo33gL三氯化铁溶液：取三氯化铁LOg溶
6、于浓磷酸20mL中，加蒸储水IOmL,摇匀。酸溶液：取蒸储水800mL,慢慢加入浓硫酸50mL,边加边摇；再加入85%璘酸50mL,摇匀。加入33gL三氯化铁溶液1.5mL,加水至IL01 OmmolZL尿素标准液（尿素28.01mg/dL精确称取尿素（AR）15O.3mg溶于16mmolL苯甲酸溶液并加至250mLO16mmolL苯甲酸液：取苯甲酸2.0g溶于蒸储水IooOmL中，加浓硫酸0.8mL。2.2.3实验方法2.23.1 实验动物成年小鼠或大鼠，小鼠体重18-22g,Wistar或SD大鼠体重160-200go推荐使用雄性小鼠。2.23.2 剂量设计和分组大鼠以人体推荐量的5倍为基
7、本剂量。其余同1.3.2。2.23.3 实验步骤223.3.1高尿素模型的建立及标本制备：末次给受试样品30min后,在踱为30的水中不负重游泳90min,休息60min后采血。大鼠采尾血，小鼠拔眼球采全血约0.5mL（不加抗凝剂）置4C冰箱约3h,血凝固后2000rmin离心15min,取血清备用。血清中的尿素在室温下可稳定24h,在4一6C可稳定7天以上。用二乙酰一的法测定。2.23.3.2试剂盒操作步骤（本推荐使用的试剂盒适用于手工操作）测定管标准管空白管尿素标准液（mL）0.02标本（mL）0.02二乙酰月弓应用液（mL）3.003.003.00氯化铁一磷酸应用液（mL）2.502.5
8、02.50充分混匀，置沸水浴中煮沸10分钟，再于冷水中冷却。在520nm波长处（或绿色滤光板），以蒸储水调零,测定各管吸光度值。计算公式：测定管光密度一空白管光密度尿素（mgL）=X标准液浓度值X10标准管光密度一空白管光密度测定管光密度一空白管光密度尿素（mmolL）=X标准液浓度值:2.8标准管光密度一空白管光密度标准液浓度值为200mgLo2.23.3.3自行配制试剂按下表操作：试剂测定标准管空白管血浆/血清（mL）0.051OmmoIZL尿素标准液（mL）0.05蒸储水（mL）0.05IgZL后溶液（mL）2.52.52.5酸溶液（mL）2.52.52.5充分混匀，置沸水浴准确（A值）
9、15min,立即用自来水冷却。用波长520nm,以空白管调零，读取各管吸光度尿素含量计算尿素（InmOIL）=AUXlO/As尿素（mgdL）=AuX28.01As式中Au-测定管吸光度As-标准管吸光度2.3 数据处理及结果判定尿素数据为计量资料,可用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算产值，F值S,结论：各组均数间差异无显著性：产值2R）wP0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计：若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。若受试
10、样品组血清尿素低于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。2.4 注意事项2.4.1 为避免色度转移，应在标本加入后30min内读出吸光度值。2.4.2 一般标本测定管反应后应澄清，严重脂血可制备血滤液重新测定。243煮沸时间应准确。3肝糖原测定：蕙圉法。3.1 检测原理慈酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。测定其光密度，可以确定糖原的含量。3.2 仪器和试剂仪器：721型分光光度计，离心机，扭力天平，匀浆器，振荡器，移液泵，沸水浴，灌胃针头，手术器械，玻璃漏斗,加样器，2mL、5mL、IomL吸量管，20mL带塞刻度试管，IomL带塞离心管。3.2.
11、1 试剂：5%三氯醋酸（用蒸储水配）（TCA）葡萄糖标准液，浓硫酸（AR）慈酮试剂。意酮试剂：溶液中含0.05%的意酮，1%的硫服，用72%的H2SO4配制。配制方法如下：72%H2SO4配制：烧杯中加入28OmL蒸馅水,再加入浓硫酸720mL（比重1.84）慈酮试剂配法：当HfO4温度降至809（TC时放入50Omg恿酮，IOg硫腺，适当摇动烧杯混匀。冷却后存放于冰箱中，可保存两周。3.3 实验方法3.3.1 实验动物同2.2.3.13.3.2 剂量设计和分组大鼠剂量以人体推荐食用量扩大5倍作为基本剂量，其余同132。3.3.3 实验步骤末次给样后30min娜创物，取肝联生理盐水漂洗后用碗吸
12、干，精赚取肝脏Ioomg,加8mLTCA,每管匀浆Imin,将匀浆液倒入离心管，以3000rmin离心15min,将上清液转移至另一试管内。取ImL上清液放入IOmL离心管中（每样品可做两平行管以保证获得可靠结果）每管加入95%的乙醇4mL,充分混匀至两种液体间不留有界面。用干净塞子塞上，室温下竖立放置过夜（也可选用将试管放在37一40C水浴3h）。沉淀完全后，将试管于3000rmin离415min.小心倒掉上清液并使试管倒立放置IOmino用2mL蒸储水溶解糖原，加水时将管壁的糖原洗下。如管底的糖原不立即溶解，振荡管子直到完全溶解。制作试剂空白和标准管：试剂空白：吸2mL蒸锚水到干净离心管。
13、标准管：吸0.5mL葡萄糖标准液（含IoomgZdL葡萄糖）和1.5mL蒸储水放入同样的管子。此时将IOmL慈酮试剂用力加入各管，液流（慈酮试剂）直接进入管子中央，保证充分混合好。从管子中注入慈酮试剂时起，将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后，将其浸于沸水浴（水浴深度略高于管子液面）15min,然后移到冷水浴。将管内液体移入比色管，在620nm波长下，用试剂空白管调零后测定吸光度。根据所称取的肝脏重量换算成肝糖原含量（以mg/g肝表示）并进行统计分析。333.3 糖原含量计算：DU提取液体积每100克肝组织中糖原的亳克数=0.5100X0.9DS肝组织克数DU：样品管吸光度DS
14、：标准管吸光度0.5：为0.5mL葡萄糖标准液液中的葡萄糖含量。0.9：为将葡萄糖换算成糖原的系数。提取液体积：为8mL肝组织克数：为0.1g333.4 处理及结果判定肝糖原数据为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，产值尸Sg结论：各组均数间差异无显著性：产值2R）o5,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。333.5 试样品组肝糖原含量明显高于对照组，且差异有显著性
15、，可判定该实验结果阳性。333.6 事项333.6.1 的实验方法均为定量要求，因此所有取样加试剂均需准确。333.6.2 测定中冷却、加热时间与氧化还原作用有关，因此时间要控制准确。333.6.3 显色剂不稳定，以临用时配制为宜，注意避免采用绒布或被污染的糖类进入恿酮反应。4血乳酸测定4.1 原理4.1.1 自配试剂测定方法：在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物，在波长56Onm处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。4.1.2 乳酸盐测定仪测定方法：检测探头上装有一片三层的膜，其中间层为固定的乳酸盐氧化酶。表面被膜覆盖的探头位于充满缓冲液的样品室内，当样品被注入样品室后，部分底物会渗进膜中；当它们接触到固定酶（乳酸盐氧化酶）时便迅速被氧化，产生过氧化氢。过氧化氢（H2O2）继而在钳阳极上被氧化产生电子。当过
