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1、2.标准曲线制备与操作。（1）蛋白标准需要新鲜稀释配制（蛋白标准稀释后，请立即使用，余下废弃，不可再用），取IOul浓缩蛋白标准（50mgml）,加入990ul稀释液配制成0.5mgml蛋白标准。（为减少稀释产生误差，总稀释体积不可太小）为保持样品和标准测定条件同一，蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。一般要求，可以用0.9%NaClPBS或水直接稀释标准品。（2）按下表格操作编号123456789标准稀释液同2019181612840蛋白标准R01248121620样品R20蛋白对应浓度XJang/ml00.050.100.200.400.600.81BCA工作液l2002002
2、00200200200200200200混匀，37C放理之间也可接受）t20-30分钟，冷却到室温，i,根据标准曲线计算出蛋白划定A562的吸光度（540-595nm浓度注：样品和试剂比可以按比例放大或缩小。微孔检测时，可以按比例缩小，但总体积不小于100uL产品特点：1 .准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20-2000gml,采用加强方法可检测到5gml02 .快速：45分钟内完成测定。3 .可在微孔板中进行。4 .相对于其他方法干扰因素较少。5 .不同蛋白质分子的变异系数远小于Bradfordo6 .不受低浓度的EDTA、EGTA、DTT硫酸钱、脂类的干扰7 .标准曲线接近直线，可以
3、单点定标。需要设备：540-595nm的陶标仪一台，测定波长为之间，562nm最佳。需96孔板。或者普通的分光光度计测定，但测定时，需根据比色皿的最小检测体积，按比例放大反应体系。注意：1 .在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37C温育使溶解。2 .高浓度EDTA、EGTA、DTT、硫酸铁、脂类会影响检测结果，改用本公司Bradford法测定。3 .当样品蛋白浓度较高时，可以采用BiUret法蛋白定量试剂盒（双缩麻法）4 .试剂A与试剂B用应密闭保存。5 .如发现样品稀释液或裂解液本身就有较高背景，改用本公司Bradford法测定或BiUret法蛋白定量6 .本试剂仅用于科学研究；操作步
4、骤：1.配制工作液：根据标准品和样品数量，试剂A与试剂B按50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。BCA Protein Assay KitioBCA蛋白质定量试剂盒货号Cat：包装规格微孔检测WB051试剂A25ml试剂BLOmlBSA(50mgml)0.3ml125次WB052试剂A100mI试剂B2.5mlBSA(50mgml)Iml500次贮存：蛋白标准20C保存，其他室温或28保存。注意：试剂有腐蚀性，如接触皮肤眼睛等，请用大量水清洗,星宝生物Tek400-600-6237常见问题：1 .是否每次测定时都需要做标准曲线？建议每次测定时都做标准曲线。因为
5、BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则如需精确测定宜每次都做标准曲线。2 .测定发现随着样品浓度与吸光度（或颜色）没有明显变化。可能是样品中含有严重干扰BCA法测定蛋白浓度的物质，以下是不干扰本方法测定的物质浓度：成分相容浓度成分相容浓度NP-4050葡葡糖10mMEmulgen1.0EDTA1011Hepes100mMSodiumChloride1.0MDTT1mMNaOH0.1MGuanidineHCl4.0MAmmoniumSulfate1.5MTritonX-1005.0乙酸钠pH5.5200m.M辛基糖苗5.球SDS5.0%Urea3.0MBrij-355.0%蔗糖期Lubrol1.0%Glycine,PH2.8100mMCHAPS5.0%3 .三种蛋白定量试剂盒比较BradfordBCABiuret线性2O12OOug/ml20-2000g/ml1.7140mgml精密性一般较好最好灵敏性1g（加强试验）5ug（加强法）850ug干扰物质较多较少极少
