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1、活化部分凝血活酶时间延长混合血浆纠正试验“灰区”解决方案探究纠正试验是实验室筛查凝血时间延长病因的常用手段。基本原理是将凝血时间延长的患者样本和正常混合血浆混合后，再次检测凝血时间，通过判断该凝血时间是否纠正以及孵育后是否延长，初步筛查凝血时间延长的原因1,2o活化部分凝血活酶时间（activatedpartiaIthrombopIastintime,APTT）单独延长是凝血筛查试验异常中常见的一种情况，因此APTT延长混合血浆纠正试验（以下简称APTT纠正试验）的应用也极为广泛3o2021年8月活化部分凝血活酶时间延长混合血浆纠正试验操作流程及结果解读中国专家共识正式发布（以下简称“共识”）
2、1,该共识的发布为APTT纠正试验的操作和结果解读提供了理论和实践依据，但共识推荐的Rosner指数10%15%为结果判读的“灰区”，如何解读“灰区”结果是亟待解决的临床问题。本研究旨在探索解决“灰区”问题的方案，建立APTT纠正试验结果判断的临床应用路径，为完善APTT纠正试验结果的解读提供依据。对象与方法一、对象收录2018年1月1日至2019年12月31日就诊于四川大学华西医院APTT单独延长的患者样本作为建立组，2020年1月1日至12月31日的同类样本作为验证组。纳入标准为：（I）APn超过正常参考范围上限（33.8s）;（2）PT、TT和Fib位于正常参考范围。排除标准为：（1）肝
3、功能异常；（2）正在使用抗凝药物。所有样本均使用3.2%枸檬酸钠抗凝管收集，1500Xg离心15min后分离乏血小板血浆-20C或-80C冻存，1个月内完成检测。本研究通过四川大学华西医院伦理委员会批准（审711号）。二、方法对所有样本均使用SYSMEXCS-5100全自动凝血分析仪（日本希森美康公司）及配套试剂（德国西门子诊断公司）检测1.A、FVlAFlX、FXI、FXII4和凝血因子抑制物5,6,使用YH1.OiFlash3000化学发光分析仪及配套试剂（深圳亚辉龙公司）检测ACA和抗B2GP1抗体的总抗体，以明确因子缺乏4或存在抗磷脂抗体7（antiphosphoIipidantibo
4、dies,AP1.）或凝血因子抑制物5,6导致的APTT延长。纠正试验操作步骤见图1,结果判断采用共识中推荐的ROSner指数计算公式：（C-B）/A100（%）1、孵育后延长时间计算公式：（C-E）8、孵育后延长时间百分比-N计算公式：（C-E）B/X100（%）和本研究建立的1:1联合4：1及孵育后延长时间百分比-P判断标准计算公式：(C-E)A,100(%)O注：患者和正常混合血黑分别为AfflB:分别将惠者龙家和正常闻1S41荔合后H)得到CffiD:将上述A、B、C和D放置于37,CW2能再次检3BAP)为A.B.CWD,;哂后的A，和&分别按鲤1：1或41的比例混合.得到E和F:虐
5、法表示解育后血浆图1APTT纠正试验操作流程三、统计学分析应用SPSS19.O进行统计分析并绘制受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲线。计算不同判断方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值9,10,11,12以评价其诊断效能。借助ROC曲线寻找不同判断方法在本实验室的最佳界值13,以建立最优方案和路径用于纠正试验的结果解释。以P0.05为差异具有统计学意义。结果一、建立组和验证组的一般情况建立组共收录2018年1月1日至2019年12月31日符合纳入标准，同时不存在排除标准的样本251份，其中因子缺乏的样本116份，存在抗磷脂抗体的样本
6、60份，存在FVIIl抑制物的样本75份。以上所有样本均完成1:1混合纠正试验。由于部分样本样本量不足，最后有134份样本完成了4:1混合纠正试验，其中包括88份因子缺乏，22份FVilI抑制物和24份AP1.。前期详细比较了多种判断方案的应用效能，并已统计发表14,在征得期刊同意后，采用该数据作为本研究的前期基础。验证组共收录2020年1月1日至12月31日符合纳入和排除标准的样本73份，其中因子缺乏30份，抑制物43份，其中FViIl抑制物12份，另31份含有AP1.o二、“灰区”解决方案探索1.纠正试验即时部分：RoSner指数10%15%为共识推荐1：1混合纠正试验结果解读的“灰区”，
7、建立组中17.9%（45/251）的样本位于“灰区”无法判断。根据ROC曲线，我们重新建立了本实验室1:1混合纠正试验的最佳判断界值9.1%,其对抑制物的敏感度由25.2%提升至63.0%o4：1混合能进一步提高低滴度抑制物的检出率1,15,使用15.9%作为判断界值时对抑制物的敏感度由63.0%提升至95.7%（图2和表1）o图2ROC曲线寻找不同判断方法的最佳界值（2A为1:1混合纠正试验的RoSner指数区分因子缺乏和抑制物;2B为4：1混合纠正试验的ROSner指数区分因子缺乏和抑制物；2C为1：1混合纠正试验的孵育后延长时间、孵育后延长时间百分比-P和-N区分抑制物是否具有时间依赖性
8、，其中孵育后延长时间百分比-P和-N两条ROC曲线重叠；2D为4:1混合纠正试验的孵育后延长时间、孵育后延长时间百分比-P和-N区分抑制物是否具有时间依赖性，其中孵育后延长时间和孵育后延长时间百分比-N重叠）表1建立组中传统方案和本实验室判断方案解读APTT纠正试验的诊断效能评价方法传垃方庭（%）a1saft(%)b41混合的IN正试的（%）C界值9BR特异度界佰AUC(95%C7)敏感度特异度界值AUC(95%CT)精算度RosnerfSSt因子缺乏10%97.425.29.1%0.82(0.770.88)96.663.015%25297.49.1%63.096.615.9%95.79S.2
9、羯肓后延长时间町间依藏性3S90.770.03.4S0.89(0.83-0.95)89378.35.8S0.94(0.85-l.)95.595.83S70.090.73.4S78389.310%85383.321.3%0.96(0.88-1.00)100.095.820.6%0.94(0.85-1.00)95.595.810%83385.321.3%95.8100.015%6096.7-画国依籁性10.8%0.%(0.8vl.00)100.095.813.5%0.92(0.821.00)95.595.8三团间依雌-10.8%95.8100.013.5%95.895.5注：a共Xe推荐的区分因子
10、热乏到物物的械方型国ROSnerfS数”便再RoC画好裸友实检室11混够正侬港果第读时不同轲断方案的景佳界值.C使用ROC曲的案本尖聆至4：1:戛合纠正侬结S!解蝴不司判阡方案跆IB佳界8.AuC力受试者工作西线下;程.95%95%可信区闻.-兀无SnB2 .纠正试验孵育部分：本研究根据ROSner指数建立的孵育后延长时间百分比-P（1：1混合10.8%,4:1混合界值为13.5%）用于判断抑制物具有时间依赖性较共识推荐的孵育后延长时间03s）和孵育后延长时间百分比-N（超过10%15%）诊断效能更高（表1和图2）o3 .APTT纠正试验操作流程和临床应用路径的建立：上述结果提示1：1联合4：
11、1混合的纠正试验可有助于进一步提高低滴度抑制物的检出率。为探索进行4：1混合纠正试验的时机，本研究定义1：1混合纠正实验判断因子缺乏或抑制物的敏感性至少应达到90%（即RoSner指数分别为5.0%和9.1%）,该临界点才可作为“启动时机”。即1：1混合纠正试验RoSner指数5.0%考虑为因子缺乏，9.1%考虑抑制物，对于5.0%9.1%的样本应进行4：1混合纠正试验进一步判断。图1和图3分别为本研究建立的操作流程和临床应用路径。图3APTT纠正试验结果判断及临床应用路径三、验证组验证方案和路径的诊断效能在验证组中我们分别比较了传统方案、在本实验室仅使用1：1混合纠正试验和联合使用1：1和4
12、：1混合纠正试验的诊断效能，发现3种方案区分因子缺乏和抑制物的准确度逐步升高，尤其是对于抑制物的敏感性由传统方案的69.8%提高至仅使用1：1混合纠正试验时的83.7%,再到联合使用1：1和4：1混合纠正试验的93.0%。对于区分抑制物是否具有时间依赖性的准确度也由63.3%提高至97%（表2）o表2验证组验证传统方案和本实验室方案解读APTr纠正眯的临床效能（%）-传妩方案仅使用11益合的纠正方的联合11K141混合的娟正SJSS将异度PPVNPV海崎度KSlS将异度PPVNPV灌施箕敢感亥牯异度PPVNPV潜确度RosnefIftRS?玦乏96.769.876.396.880.896.78
13、3.780.697.389.093.393.090.395.293.1KDVflS69.896.796.876.380.883.796.797.380.689.093.093.395.290.393.1器青后延长时间百分比-P三团间依IS性-100.087596.6100.097.2100.088.996.7100.097.4对间侬87.5100.0100.096.697.288.9100.0100.096.797.4孵育后延长5!间m卸间依IMi542100.0100.035.363.3-时间侬IMI100.054.235.3l.0633-注：PpV的性贫更值,NpV性预和值.-力元双JS讨
14、论单独APTT延长是临床较常见的异常结果，排除检测或药物影响，导致其异常的原因主要为内源性凝血因子（FVIlI、FIX、FXKFXIK高相对分子质量激肽原HMWK和前激肽释放酶PK）缺乏（因HMWK和PK缺乏罕见，本研究未涉及）、存在AP1.和内源性凝血因子抑制物等情况1oAPTT纠正试验结果不仅为临床医生和检验医师精准选择确诊试验提供依据，更重要的是能有效避免抑制物影响导致误诊，减少患者因误诊和过多检查所致的经济负担和医疗资源浪费。APTT纠正试验简单、可操作性强，受到越来越多的临床医生和检验医师的关注，随着共识1的发布，其实施的标准化、普及性必将进一步改进和扩大。遗憾的是，共识和文献中都提到不统一的操作流程、众多的结果解释方案限制了APTT纠正试验的应用，目前共识中最推
