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1、项目说明及技术部分评分参数一、采购标的名称：结核菌靶基因测序服务预算金额（万元）：22.6项目联系人：北京胸科医院病理科车佳璐二、采购需求结核杆菌靶基因突变位点检测（本实验为灭活菌株，不具有传染性）三、技术要求1、采购内容明细样本类型：痰样本DNA样本数量：226个每项样本检测服务内容的控制价：IOOO元（不满足为废标项）2、检测标准及指标要求引物设计将靶基因全部覆盖，对应amplicon的测序深度均一，覆盖深度大于IOo0,有效数据占比大于90%o下机后提供位点信息及原始数据。四、商务要求#1、服务期限：60个工作日内完成测序和数据反馈及剩余样本返回。2、服务地点：公司3、付款条件（进度和方
2、式）：凭公司提供的结题报告、发票在两周内以银行转账方式支付。五、服务要求#1、技术服务人员的相关要求（如适用）：精通测序原理，可以解答相关实验细节问题，对于数据分析可以提供必要的指导。2、拟投入实验仪器及设备（如需）要求：IifC平台（不满足为废标项）3、其他服务要求# 1.具有C1.IA和室间质评一类资质# 2.提供以往同类实验服务（靶基因测序）报告或报告样板包括覆盖率#、平均测序深度#、测序深度均一性#提供位点信息#（突变位点#,相应测序深度#,突变频率#,每个amplicon的测序深度#）# 3.样本检测报告反馈时间小于7天4.后续服务免费（不满足为废标项）*5.按时返回剩余样本#6.提
3、供每个样本的质控信息测序服务要求测序平台：Iife平台具体服务内容：针对临床样本检测结核菌靶基因的引物设计及二代测序实验。要求：引物设计将靶基因全部覆盖,对应amplicon的测序深度均一,覆盖深度大于1000,有效数据占比大于90%o1 .文库构建：将PCR酶混合液、DNA扩增引物混合液和DNA样本取出，置于冰上待融化后，涡旋振荡混匀离心，置于冰上备用。表IoDNA目标区域扩增反应条件阶段温度时间循环数酶的激活992分钟1变性9915秒25退火和延伸604分钟保持IOoC最多1小时一2 .引物的消化将消化酶取出，轻弹混匀（避免振荡），瞬时离心，置于冰上备用；将PCR扩增产物从PCR仪中取出，
4、瞬时离心后，在每管扩增产物中加入2U1.的消化酶，用移液器吹打混盖紧PCR管盖，瞬时离心，以收集管壁和管盖上的残余反应液，将PCR管置于冰上备用。表11引物消化反应条件温度时间5010分钟5510分钟6020分钟10保持（最多1小时）3 .扩增子的接头连接将Pl接头，1-48种待用的特异性接头，DNA连接酶缓冲液取出，室温融化后，涡旋振荡混匀离心，置于冰盒上备用；取出DNA连接酶轻弹混匀离心，置于冰盒上备用；将文库纯化磁珠充分涡旋混匀离心后置于室温至少30分钟表12一个反应所需接头混合液的配制组分体积Pl接头0.51.特异性接头0.51.无核酸酶水l1.总体积21.将配制好的接头混合液涡旋振荡
5、混匀后，瞬时离心，置于冰上备用。连接体系的配制从PCR仪中取出含引物消化产物的PCR管，按照表13要求向其中依次加入DNA连接酶缓冲液、接头混合液、DNA连接酶用移液器吹打混匀后，盖紧PCR管盖，瞬时离心，以收集管壁和管盖上的残余反应液，将PCR管置于冰上备用连接反应将PCR管置于PCR仪上，按照表14设置程序，进行连接反应：表14扩增子接头连接反应条件温度时间2230分钟7210分钟10保持（最多1小时）3文库纯化磁珠纯化文库1）PCR反应结束将八联排放置在小黄板上，向各管中分别加入45UI的文库纯化磁珠（1.5*体积），涡混使磁珠和DNA充分混匀，盖好八连管盖。2）室温静置5InirI,使
6、磁珠和DNA充分孵育结合。3）将八联排简短离心后置于96孔磁力架上5min,至溶液澄清，弃废液，注意枪头不要碰到磁珠。4）加入190UI新鲜配制的70%乙醇，稍静置，翻转八联排2次，移液器调至200UI小心地吸除PCR管中的上清，注意枪头不要碰到磁珠。5）重复步骤4）一次。6）用IOUI的移液器吸除残余的乙醇，开盖2-4min使乙醇完全挥发，干燥程度以没有反光表面略粗糙最好。注：乙醇残留会抑制后面的文库扩增。7）将八联排从磁力架上取下，向PCR管中加入30UI文库洗脱液，涡旋振荡混匀，简短离心以收集管壁和管盖上的残余溶液。8）将八联排简短离心后置于磁力架上2min至溶液澄清，用移液器小心地转移
7、25ul上清至新的EP管中，即纯化的文库，在EP管上标记文库编号。4测定文库浓度使用Qubit测定每个文库的浓度，并计算其总量。1）向0.5UI离心管中加入198UIdsDNAHSBuffero2）力UIUIdsDNAHSReagent染料混匀。3）力UlUI样本震荡混匀，简短离心后避光静置2分钟测其QUbit。5文库qPCR定量1）文库定量标准品的梯度稀释a.将文库定量标准品置于冰上彻底融化，充分振荡混匀，简短离心后置于冰上备用；b.用无核酸酶水将标准品（68pM）按下表进行10倍梯度稀释，涡旋IOS后简短离心，重复3次，置于冰上备用。标准品文库标准品无核酸酶水稀释倍数终浓度Sl51.（未稀
8、释）451.106.8pMS251.Sl451.IOO0.68pMS351.S2451.10000.068pMS45H1.S3451.100000.0068pM2）AnIPIiSeq文库的梯度稀释将文库按1:20进行稀释，再按1:50进行稀释，建议冰上操作:名称文库Nuclease-freeWater总稀释倍数Sample1-12U1.文库381.1:20Sample1-221.Sample1-1981.1:10003）PCR反应体系的制备将文库定量探针反应液涡旋振荡后离心备用，文库定量混合液轻柔颠倒混匀离心备用（MasterMix不能vortex）。4）反应体系配制a.每个样品做2个平行实验
9、。b.实验的反应体系101.,根据反应总数配制MaSterMiX和ASSay混合的总体系：试剂单个样本文库定量反应体系总量文库定量混合液51.2*（文库总个数十标准品个数4）+损耗5*5文库定量探针反应液0.51.2*（文库总个数+标准品个数4）+损耗5*0.5c.将配制好的文库定量反应体系轻柔颠倒混匀后，分装8联管中，每孔分配5.5ul.d.分别取4.51.I1.稀释的标准品（SI,S2,S3和S4）和稀释适当倍数的文库加入至相应的qPCR管中，盖紧PCR管盖，短暂离心后涡旋振荡混匀再离心，放入qPCR仪中。e.Real-timePCR仪的设置：1）依次设置标准品的浓度。2）设置RoX作为参
10、考染料，选择FAMBI染料/MGB作为TaqMarl探针的报告/淬灭剂。3）反应体系IOIl1.。4）选择“Standard”作为运行模式。5）设置反应条件（其他型号仪器查询官网）。阶段温度时间循环数UDG孵育50oC2min酶的激活95oCImin变性95oC15s40退火和延伸60oC45s5）数据的处理根据QPCR结果，计算出未稀释的文库浓度（QPCR浓度乘以相应的稀释倍数）。6）文库质控标准文库QPCR浓度20pM,即此文库合格7）文库的稀释及混样（按照POOIing信息表进行POOIing）混样总体积1001.,浓度6pMo要求：实验完成后提供每一步样本质控信息。数据分析要求：下机后公司负责原始数据处理分析，提供数据质控：覆盖率、平均测序深度、测序深度均一性，提供位点信息（突变位点，相应测序深度，突变频率，每个amplicon的测序深度）及原始数据。
