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1、第四章第四章 微生物诱变育种微生物诱变育种诱变育种：诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传结构和功能，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优结构和功能，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优良的突变株，良的突变株， 并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。基因突变是微生物变异的主要源泉，人工诱变是加速基因突基因突变是微生物变异的主要源泉，人工诱变是加速基因突变的重要手段。诱变育种有以下几个优点：变的重要手段。诱变育种
2、有以下几个优点：速度快、收效大、速度快、收效大、方法简单。方法简单。分三个阶段：菌种基因型改变，分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估突变体筛选，产量评估1. 遗传性状稳定遗传性状稳定2. 纯净无污染纯净无污染3. 繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物4. 能诱变产生遗传性变异能诱变产生遗传性变异5. 具有产量高、收得率高具有产量高、收得率高理想的工业生产菌种必须具备：理想的工业生产菌种必须具备： 出发菌株的选择出发菌株的选择 单孢子（单细胞）悬液的制备单孢子（单细胞）悬液的制备 诱变剂及诱变剂量的选择诱变剂及诱变剂量的选择 诱变
3、处理方法诱变处理方法 高产菌株的分离高产菌株的分离第一节第一节 诱变育种的步骤诱变育种的步骤对出发菌株的要求：对出发菌株的要求：1. 对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高 2. 具有一定生产能力具有一定生产能力 3. 具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株早而多的菌株一、出发菌株一、出发菌株4. 有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。5. 采用一类被称为采用一类被称为“增变菌株增变菌株”的变异菌株，它们对诱变的变异菌株，它们对诱
4、变剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。6. 在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积少量所需产物或其前体的菌株少量所需产物或其前体的菌株; 而在选择产抗生素的出发而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。有一定程度提高的菌株作为出发菌株。 连续诱变育种过程中如何选择出发菌株连续诱变育种过程中如何选择出发菌株?突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提突变株的
5、产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提高发酵水平不太容易。高发酵水平不太容易。在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加 菌号菌号诱变代数诱变代数菌落大小菌落大小/cm菌落表面菌落表面结构结构菌落颜色菌落颜色可溶性色可溶性色素素变株效价变株效价提高提高/%454111.3平滑疏松龟背灰绿赭石10071046100.8平滑紧
6、密白火泥棕2011B-53110.6平滑紧密白海螺橙2642C-04自然分离后0.5平滑紧密白淡可可棕3547D-756 130.4平滑紧密白鱼鳃红6911灰黄霉素高产菌灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系二、单孢子（单细胞）悬液的制备二、单孢子（单细胞）悬液的制备对菌悬液的制备有如下的要求：对菌悬液的制备有如下的要求：1. 供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮 2. 供试细胞培养物要新鲜供试细胞培养物要新鲜3. 菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子制备方法：制备方法
7、：1. 采取分散法采取分散法2. 菌悬液中细胞的浓度，要求霉菌孢子浓度约为菌悬液中细胞的浓度，要求霉菌孢子浓度约为106/ml，放，放线菌孢子浓度约为线菌孢子浓度约为106-107/ml。3. 制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化变化而影响诱变效果。而影响诱变效果。 1. 诱变剂种类选择诱变剂种类选择对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂。变谱较宽的、诱变率
8、高的强诱变剂。对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂。对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂。对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可能出现能出现“钝化钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。现象，此时则需改用另外的诱变剂。三、诱变剂及诱变剂量的选择三、诱变剂及诱变剂量的选择2. 最佳剂量的选择：最佳剂量的选择：经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株，经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株，宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理。宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理。要筛选具有特殊性状的菌株、较大幅度提高产量的菌株，要筛选具有特殊性状
9、的菌株、较大幅度提高产量的菌株，则用强诱变剂和高剂量处理。则用强诱变剂和高剂量处理。对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处理。对多核细胞菌株，用高剂量处理。理。对多核细胞菌株，用高剂量处理。诱变处理方式：诱变处理方式：单因子处理：是采用单一诱变剂处理（一般突变率低）单因子处理：是采用单一诱变剂处理（一般突变率低）复合因子处理：是指采用两种以上诱变因素处理（突变率高）复合因子处理：是指采用两种以上诱变因素处理（突变率高）分下列几种情况：分下列几种情况：1. 两个以上因子同时处理两个以上因子同时处理2. 不同诱变剂交替处理不同诱变剂交替处理
10、3. 同一诱变剂连续重复使用同一诱变剂连续重复使用4. 紫外线光复活交替处理紫外线光复活交替处理四、诱变处理方式四、诱变处理方式随机突变，定向筛选。随机突变，定向筛选。筛选的条件决定了选育的方向，设计一个好的筛筛选的条件决定了选育的方向，设计一个好的筛选方案是诱变育种的重要前提。选方案是诱变育种的重要前提。五、突变体的分离和筛选五、突变体的分离和筛选出发菌株出发菌株诱变诱变绝大多数个体死亡绝大多数个体死亡少数存活少数存活少数突变少数突变多数未变多数未变多数负变多数负变少数正变少数正变少数变幅大少数变幅大多数变幅小多数变幅小少数宜投产少数宜投产多数不宜投产多数不宜投产存活率存活率 突变率突变率正
11、变率正变率高产率高产率 投产率投产率第一代：出发菌株第一代：出发菌株分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）挑选菌落挑选菌落 200个个初筛初筛 1瓶瓶/株株3-5株（提供第二代诱变出发菌株）株（提供第二代诱变出发菌株）诱变诱变50株复筛株复筛常规筛选程序：常规筛选程序：第二代：出发菌株第二代：出发菌株4株株分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）挑菌落挑菌落 初筛初筛 1瓶瓶/株株3-5株（提供第三代诱变出发菌株）株（提供第三代诱变出发菌株）诱变诱变挑挑50株复筛株复筛100个个1
12、00个个100个个100个个第一代：出发菌株第一代：出发菌株分离到平皿上分离到平皿上打琼脂块挑菌落打琼脂块挑菌落1000-3000 块块挑取挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落选选3-5株（提供第二代诱变出发菌株）株（提供第二代诱变出发菌株）诱变诱变初筛初筛置于检定板上置于检定板上选选30-50个菌株个菌株复筛复筛简便筛选程序简便筛选程序第二代：出发菌株第二代：出发菌株4株株分离到平皿上分离到平皿上打琼脂块挑菌落打琼脂块挑菌落1000-3000 块块挑取挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落选选3-5株（提供第三代诱变出
13、发菌株）株（提供第三代诱变出发菌株）诱变诱变初筛初筛置于检定板上置于检定板上选选30-50个菌株个菌株复筛复筛青霉菌的选育青霉菌的选育2 U/ml 85000 U/ml 营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。第二节第二节 营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型菌株的筛选 一、营养缺陷型菌株的分离和筛选一、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般包括：一般包括
14、：诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别缺陷种类缺陷种类等等4个步骤。个步骤。 （一）营养缺陷型的诱发（一）营养缺陷型的诱发常用的方法有抗生素法和菌丝过滤法。常用的方法有抗生素法和菌丝过滤法。（二）淘汰野生型菌株（二）淘汰野生型菌株1. 抗生素法抗生素法常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。霉素法，后者用制霉菌素法。青霉素法的原理为：青霉素法的原理为：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完而
15、青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细菌。菌。制霉菌素法原理：制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇，制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型菌株的作用。营养缺陷型菌株的作用。1. 诱变后的菌体用完全培养液振荡培养诱变后的菌体用完全培养液振荡培养2-3代，以结束表代，以结
16、束表型延迟现象型延迟现象2. 进行离心、洗涤，转移到基本培养基中进行饥饿培养进行离心、洗涤，转移到基本培养基中进行饥饿培养4-6h 3. 转移到含无机氮的培养基中培养转移到含无机氮的培养基中培养3-4h，加入一定浓度的，加入一定浓度的青霉素青霉素4. 经涂布培养后，统计完全培养基和基本培养基上菌落的经涂布培养后，统计完全培养基和基本培养基上菌落的差数，确定产生最多缺陷型的青霉素溶度差数，确定产生最多缺陷型的青霉素溶度青霉素淘汰细菌野生型细菌的步骤：青霉素淘汰细菌野生型细菌的步骤： 2. 菌丝过滤法菌丝过滤法真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3-4h过过滤
