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1、2023间充质干细胞治疗终末期肝病的临床研究进展肝脏具有消化、解毒、内分泌等多种功能，并且有强大的自我再生能力。终末期肝病(ESLD)是指各种损伤引起的肝脏结构和功能不可逆改变已经到了晚期阶段,包括各种类型的肝衰竭、失代偿期肝硬化,预后通常很差。肝移植是治愈此阶段患者唯一的方法,但肝源短缺、移植后免翩E斥、费用昂贵等问题极大限制了其在临床上的应用。近年来兴起的细胞疗法得到了广泛关注，其中的干细胞疗法更被认为是有极大前景的肝移植替代疗法Ho1间充质干细胞(MSC)是肝病治疗领域应用最广的干细胞干细胞是一组具有多向分化潜能的细胞群，在体外适宜条件下可以被诱导分化为肝细胞样细胞(HLC),具有完整的
2、肝细胞功能。此外，它还可以旁分泌很多细胞因子，改变受损肝脏的局部微环境，调节免疫功能减轻肝脏炎症损伤，刺激肝细胞再生。临床上常用的干细胞包括：MSC、胚胎干细胞(ESC)和造血干细胞(HSC)等。ESC受限于免疫SE斥问题，而HSC体外增殖能力有限，古攵应用MSC治疗肝病的研究最为广泛。MSC主要集中在人的骨髓和脐带血，从来源上可将MSC分为骨髓间充质干细胞(BM-MSC)、脐带间充质干细胞(UC-MSC)、脂肪间充质干细胞(AMSC)等。因其不表达MHCn类抗原，很少表达MHCI类抗原，故免疫原性很低，MSC移植具有较高的安全性。BM-MSC迁移能力最强，旁分泌功能强大2,是当下研究的热点。
3、其分泌的外泌体(EXO)是一种细胞外囊泡，携带了多种生物活性物质，包括蛋白质、miRNA和DNA等3。它可以代替母细胞通过调节不同靶细胞的信号通路发挥作用，是很有前景的无细胞治疗方案。2干细胞治疗肝病的机制2.1 干细胞可以分化为HLC发挥功能并向受损肝脏归巢20世纪初，Yan等4通过体外培养从肝硬化失代偿期患者外周血中分离BM-MSC,发现重组人肝细胞生长因子可以诱导干细胞转分化为HLCo进一步在动物实验中借助示踪蛋白发现移植的BM-MSC首先向肺部累积，之后才向损伤的肝脏归巢。Yu等将人的UC-MSC移植入肝脏受损的小鼠体内，小鼠肝脏HE染色显示坏死肝脏面积缩小，且人白蛋白、细胞角蛋白-1
4、8染色呈阳性,说明人UC-MSC可以归巢到受损组织并分化为有功能的肝细胞。但到目前为止，MSe归巢的机制还未完全阐明，干细胞分化程度不足、效率低下的问题仍需更多实验来探索解决。2.2 干细胞通过旁分泌机制调节免疫、抑制纤维化修复受损肝脏随着研究的深入，人们认识到MSC通过旁分泌机制改变肝脏局部微环境比向HLC转分化对于肝脏的修复更重要7,这种机制主要通过MSC旁分泌细胞因子的方式调节机体的免疫，进而改善肝脏的纤维化，这些细胞因子包括口川朵胺2,3-双加氧酶(ID0)、前列腺素E2(PGE2)转化生长因子B(TGF-B)等8。对固有免疫来说,MSC可以诱导巨噬细胞向M2亚型极化，分泌IL-Io并
5、清除坏死的肝细胞，缓解肝脏炎症损伤9。NK细胞的功能也不同程度受到MSC影响，表现为功能激活或功能抑制。对适应性免疫来说，T淋巴细胞和B淋巴细胞功能均被抑制。已有研究10表明，MSC释放的TGF-阿以抑制ERK1/2的磷酸化,影响细胞周期蛋白使之停止在G1期，进而减少T淋巴细胞的增殖。还有临床研究结果口1表明T淋巴细胞的分化亦受MSC影响，自体BM-MSC移植治疗HBV相关性肝硬化患者的外周血中Thl7细胞向肝脏流入减少，调节性T淋巴细胞(Treg)数量增加。与MSC共培养的B淋巴细胞的增殖能力和分泌抗体能力也出现大幅下降，其表面CXCR4等趋化因子受体表达减少12。MSC可以通过下调TGF-
6、1受体和平滑肌爆几动蛋白(CC-SMA)等的表达问接减轻肝脏纤维化13。MSC分泌乳脂小球-EGF因子8(MFGE8)减少星状细胞表面的TGF-1受体表达，还可以通过激活Notch通路下调星状细胞的-SMA表达,从而抑制星状细胞的活化14。除Treg和Thl7细胞比例失调外JL-17水平也有显著下降，两者共同抑制了星状细胞活化并促进其凋亡，进而影响了I型胶原的沉积及胞外基质的合成口5,相关动物实验结果表明这可能和TGF-Smad通路、NADPH氧化酶通路被抑制有关16。止匕外，MSC还可以分泌基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-14等直接降解胞外基质17o直接和间接两种途径协同减轻了肝脏纤维
7、化的程度。2.3 EXo通过多种机制减少肝脏损伤并助其再生Exo是一种携带多种生物活性物质的细胞外囊泡,从MSC分泌的Exo由于其无细胞特性日益受到重视。和细胞相比，Exo体积更小,结构更简单，更容易合成和保存，形成肿瘤的风险也更小。更重要的是，因其膜蛋白数量更少故免疫原性也远低于MSCz能避免干细胞直接移植带来的很多问题。研究18发现，MSC-Exo能减轻肝移植中肝的缺血再灌注程度,这可能和EXO激活鞘氨醇激酶和鞘氨醇-I-磷酸通路有关。在刀豆球蛋白-A(Con-A)诱导的肝损伤小鼠模型19中发现，Exo可以迁移到肝脏，增加肝组织增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白D1(cyclinDl
8、)的表达,使肝细胞从GO期进入G1期。Zhao等20发现Exo通过自噬途径减少肝细胞的凋亡,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增多,促凋亡蛋白cleavedcaspase-3表达减少。Lin等21发现Exo中let-7a-5p通过MAP4K3通路增加转录因子EB(TFEB)的核转位来增强肝脏自噬活动,最终缓解慢加急性肝衰竭(ACLF)患者的肝损伤。Exo还可以通过抑制NLRP3炎症小体通路减轻肝细胞炎性损伤。有研究22发现增加Exo中miR-223的表达强度明显降低了小鼠肝组织中NLRP3的表达急性肝损伤动物模型中也发现MSC的Exo可以阻断IL-6介导的信号通路23和下调NLRP3通路24。此外，它还
9、可以降低血管内皮黏附分子1的表达下调免疫强度发挥抗炎作用25。Exo同样可以下调CCI4诱导肝纤维化大鼠的肝星状细胞中Wnt-catenin通路的信号强度26,降低星状细胞的活化程度，以此减轻肝纤维化。3干细胞治疗ESLD的临床研究在治疗肝病方面最常用的干细胞是MSC1其次是预先用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后获得的骨髓源性干细胞(BMSC),前者以BM-MSC和UC-MSC多见，供体干细胞来源多为自体或同种异体。3.1 干细胞治疗肝衰竭自体MSC移植对治疗ACLF患者是安全的，在短期内可以改善肝衰竭患者的肝功能。Salama等27对HCV相关肝衰竭患者的BM-MSC进行G-CSF动员
10、后由外周静脉自体输注，随访26周后发现，移植组54%的患者转氨酶、白蛋白、胆红素等水平得到改善。该团队28还应用自体BM-MSC经肝动脉或门静脉移植入48例肝衰竭患者，半年后患者的凝血功能国际标准化比值(INR)恢复正常水平，肝功能和腹水有所好转。Garg等29亦发现BM-MSC可以明显降低ACLF患者的肝功能评分(包括Child-PughxMELD和SOFA评分)。有研究30将自体BM-MSC在体外诱导分化为HLC后回输入体内，随访6个月后发现移植组患者的下肢水肿和腹水明显改善。Peng等31将自体BM-MSC从肝动脉输入HBV相关肝衰竭患者体内,48周后观察到血清总胆红素下降,白蛋白升高,
11、MELD评分降低。一项非盲随机对照研究32旨在探究BM-MSC治疗肝衰竭的有效性，共有56例HBV相关ACLF患者接受注射同种异体的BM-MSC(110)105个kg,每周1次，连续4周，随访24周后发现患者血清总胆红素水平、MELD评分改善，移植组的严重感染发生率较对照组显著下降(16.1%vs33.3%,P=0.04),24周累积生存率移植组显著高于对照组(73.2%vs55.6%,P=0.03)这至少表明同种异体BM-MSC在短期内可以改善肝衰竭患者的肝功能，且安全性较好。还有研究者33将UC-MSC由肝动脉注入11例HBV相关ACLF患者体内(IXIo8个/次)，4周后发现血清中白蛋白
12、、转氨酶、胆红素、INR水平和MELD评分较前改善，继续随访24个月，未观察到和输注相关的严重不良事件的发生。3.2 干细胞治疗病毒性肝炎引起的失代偿期肝硬化BM-MSC治疗病毒引起的失代偿肝硬化患者具有不错的安全性和效果。Xu等11将乙型肝炎肝硬化失代偿期患者的自体BM-MSC经肝动脉输入体内，随访24周，移植组20例完成随访，对照组19例完成随访。结果显示移植组的肝功能、MELD评分显著优于对照组。除乙型肝炎引起的失代偿肝硬化外，有研究34提示MSC治疗由HCV引起的肝硬化同样可以降低患者的Child-Pugh评分和MELD评分，同时发现MSC的注射途径和是否分化为HLC并不影响整体治疗效
13、果。但并非所有BM-MSC移植后都呈现满意的疗效。Mohamadnejad等35的研究纳入了27例肝硬化失代偿期患者，15例从外周血注射自体BM-MSCz剩余对象注射生理盐水作为对照。1年后两组间肝功能评分和INR无明显差异，该结果不排除和注射途径、BM-MSC的质量有关。G-CSF动员后的干细胞同样可以改善失代偿肝硬化患者的病情。Guo等36利用G-CSF先将失代偿期肝硬化患者的CD34+BMSC动员至外周血,之后富集外周血中的干细胞并由肝动脉回输至肝脏，发现富集后回输组的治疗效果优于单纯G-CSF动员组。之后约10年的随访结果显示，患者血清白蛋白、胆碱酯酶水平提高，凝血功能改善，MELD评
14、分下降，平均生存期由71个月延长至94个月，5年生存率由52.1%升高至71.2%。Khan等37针对HBV和HCV引起的肝硬化患者,从肝动脉注入G-CSF动员后的BM-MSC,6个月后结果提示白蛋白升高,转氨酶和胆红素下降，Child-Pugh评分改善。国外其他类似的研究38-39也发现患者移植经过或未经过动员的BMSC后未出现严重不良反应，肝功能血清学指标好转，肝功能评分明显下降，患者的临床症状和相关并发症得到缓解。G-SCF动员后，不管被移植入的是BM-MSC还是BMSC,患者都表现出了不错的耐受性，肝功能明显好转，肝脏再生活动基因表达上调40。在由肝动脉注射BM-MSC的研究中，HBV
15、相关的肝硬化患者6个月的Child-Pugh评分远低于对照组41。Zhang等42的研究将UC-MSC从外周静脉注入乙型肝炎相关失代偿期肝硬化患者体内，48周后发现患者腹水减少，肝功能和MELD评分均改善。同样的治疗方法在乙勖干炎相关ACLF患者中得到相同的结论43。Lin等44的研究探讨了UC-MSC治疗在肝硬化患者中的安全性，在移植干细胞后不同时段监测血清中血糖、总胆固醇、尿素氮、甲胎蛋白、白细胞数和凝血酶原活动度，结果表明很少有患者发生致瘤或其他严重不良反应，且UC-MSC治疗对上述血清学指标影响微乎其微，表明UC-MSC可以提高患者的生存质量，安全性值得肯定。该团队还对HBV相关的肝硬
16、化失代偿患者作了长达7年的预后随访研究,219例患者分为UC-MSC处理组108例和对照组111例，处理组共接受了3次MSC注射，每次间隔4周。结果显示，在13-75个月的总体生存率处理组高于对照组，但肝细胞癌患病率两组之间并无显著差异；48周内处理组的白蛋白、总胆红素、胆碱酯酶和凝血酶原活动度明显改善，且未出现治疗相关的并发症,结果表明UC-MSC在改善HBV相关肝硬化患者的长期生存率方面也有积极的作用45。3.3 干细胞治疗其他原因引起的失代偿期肝硬化BM-MSC可以减轻酒精性肝硬化患者的肝纤维化程度。有研究应用自体BM-MSC治疗酒精性肝硬化失代偿期患者,结果显示除肝功能和评分改善外，肝纤维化相关蛋白，如I型胶原蛋白、TGF-1等表达减少，肝脏病理也提示肝脏结构有所
