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1、课题课题2 2 月季的花药培养月季的花药培养课题2 月季的花药培养 一、课题目标：一、课题目标：说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株的两种途径，说出影响花药培养的因素，学习花药培养的两种途径，说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基本技术，尝试用月季或其他植物的花药进行培养。的基本技术，尝试用月季或其他植物的花药进行培养。二、课题重点和难点：二、课题重点和难点：选取适宜的培养材料和培养基。选取适宜的培养材料和培养基。三、技能目标：三、技能目标：知道被子植物花粉发育的过程；说出产生花粉植株的两知道被子植物花粉发育的过程；说出产生花粉植株
2、的两种途径；记住影响花药培养的因素，尝试花药培养的实种途径；记住影响花药培养的因素，尝试花药培养的实验操作过程，并进行无菌操作；知道花药培养在育种上验操作过程，并进行无菌操作；知道花药培养在育种上的意义。的意义。高度不育，秋水仙素处高度不育，秋水仙素处理，染色体加倍后可育理，染色体加倍后可育可育可育可育性可育性有性生殖有性生殖无性生殖无性生殖生殖方式生殖方式单倍体植株单倍体植株正常植株正常植株培养结果培养结果影响因素影响因素操作流程操作流程生殖细胞生殖细胞体细胞体细胞外植体细胞外植体细胞类型类型脱分化脱分化再分化再分化脱分化脱分化再分化再分化基本过程基本过程细胞的全能性细胞的全能性细胞的全能性
3、细胞的全能性理论依据理论依据月季的花药培养月季的花药培养菊花的组织培养菊花的组织培养花的结构花的结构基础知识基础知识一、被子植物的花粉发育一、被子植物的花粉发育阅读课本阅读课本P37P37P40P40一、被子植物的花粉发育一、被子植物的花粉发育雄蕊雄蕊：花丝花丝花药：囊状结构，内有很多花粉粒花药：囊状结构，内有很多花粉粒花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花花粉是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。粉是单倍体的生殖细胞。花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期花粉发育过程花粉发育过程减数分裂减数分裂有丝分裂有
4、丝分裂注意：注意：二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。时，含有一个营养核和两个精子。两个精子和一个营养核的基因型相同。两个精子和一个营养核的基因型相同。1 1花粉母细胞花粉母细胞4个小孢子个小孢子减分减分有分有分4个花粉管细胞核个花粉管细胞核4个生殖细胞核个
5、生殖细胞核有分有分8个精子个精子小孢子母细胞小孢子母细胞（2n）小孢子时期（小孢子时期（n）四分体时期（四分体时期（n）双核期双核期4个生殖细胞核个生殖细胞核（n）4个花粉管细胞核个花粉管细胞核（n）4个生殖细胞（个生殖细胞（n）4个营养细胞（个营养细胞（n）42个精子个精子(n)有丝分裂有丝分裂减数分裂减数分裂单核期（单核期（n）有丝分裂有丝分裂练习：练习：写出花粉的发育过程的发育过程（学生板书）写出花粉的发育过程的发育过程（学生板书）假如一种生物体细胞有条染色那么它的小孢子母细假如一种生物体细胞有条染色那么它的小孢子母细胞、小孢子、花粉管细胞核、生殖细胞核各有多少条染色胞、小孢子、花粉管细
6、胞核、生殖细胞核各有多少条染色体？如果小孢子母细胞的基因型为体？如果小孢子母细胞的基因型为AB（两对基因位于（两对基因位于两对同源染色体上）那么小孢子、花粉管细胞核和生殖细两对同源染色体上）那么小孢子、花粉管细胞核和生殖细胞核的基因型是什么？胞核的基因型是什么？答案：小孢子母细胞答案：小孢子母细胞个小孢子个小孢子单核居中期单核居中期单核靠边期单核靠边期花粉粒花粉粒答案：、，答案：、，AB或或A或或B或。或。无论哪一种，来源于同一个小孢子的花粉管和生殖核的基因无论哪一种，来源于同一个小孢子的花粉管和生殖核的基因一定相同一定相同二、产生花粉植株的两条途径二、产生花粉植株的两条途径花粉花粉花粉花粉胚
7、状体胚状体愈伤组愈伤组织织丛芽丛芽丛芽丛芽生根生根移栽移栽脱分化脱分化分化分化再分再分化化诱导诱导胚状体胚状体1 1、材料的选择、材料的选择2 2、培养基的组成（、培养基的组成（MSMS培养基培养基+不同比例的不同比例的激素）激素）3 3、亲本植株的生长条件、材料的低温预处、亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响定影响三、影响花药培养的因素三、影响花药培养的因素影响花药培养的因素影响花药培养的因素1 1、材料的选择：、材料的选择：不同种类植物的诱导成功率不同。不同种类植物的诱导成功率不同。同一种植物，亲本植株的生理状况对诱导
8、成功率同一种植物，亲本植株的生理状况对诱导成功率有直接影响。有直接影响。合适的花粉发育时期合适的花粉发育时期：花期早期时的花药最佳。：花期早期时的花药最佳。选择最合适的花粉发育时期选择最合适的花粉发育时期不选择单核期之前花药原因：花药质地幼嫩，容不选择单核期之前花药原因：花药质地幼嫩，容易破碎；易破碎；不选择单核期之后花药原因：花瓣开始松动，给不选择单核期之后花药原因：花瓣开始松动，给材料消毒带来困难困难；材料消毒带来困难困难；挑选单核期花药方法：应当选择完全未开放的花挑选单核期花药方法：应当选择完全未开放的花蕾，菌少，易消毒。蕾，菌少，易消毒。2 2、培养基的组成、培养基的组成花药培养所采用
9、的培养基各成分中植物生长调节剂的花药培养所采用的培养基各成分中植物生长调节剂的水平和配比起决定作用。水平和配比起决定作用。诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基：广泛使用诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基：广泛使用2 2，4-D4-D、IAAIAA和和KTKT；诱导分化的培养基常除去诱导分化的培养基常除去2 2，4-D4-D而以而以IBAIBA或或BABA等代等代之。之。3 3、其他因素：、其他因素：材料的低温处理、接种密度、培养的环境条件等对诱材料的低温处理、接种密度、培养的环境条件等对诱导的成功率都有一定的影响。导的成功率都有一定的影响。实验操作实验操作一、材料的选取一、材料的选取二、材料的消毒二
10、、材料的消毒三、接种和培养三、接种和培养（一）（一）材料的选取材料的选取 1 1、选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉、选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。是否处于适宜的发育期。2 2、确定花粉发育时期最常用方法：醋酸洋红、确定花粉发育时期最常用方法：醋酸洋红法；焙花青铬矾法。法；焙花青铬矾法。实验操作实验操作鉴定花粉：鉴定花粉：最常用的方法是醋酸洋红法：最常用的方法是醋酸洋红法：花药（载玻片上）花药（载玻片上）1%1%的醋酸洋红的醋酸洋红1 1滴滴用镊柄将花用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片药捣碎，盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）红色）某些
11、植物的花粉细胞核不易着色，需要采用焙花某些植物的花粉细胞核不易着色，需要采用焙花青青铬钒法：铬钒法：花药（在卡诺氏固定液中处理花药（在卡诺氏固定液中处理20min20min）取出，置于取出，置于载玻片上载玻片上焙花青铬钒溶液染色焙花青铬钒溶液染色盖上盖玻片盖上盖玻片镜镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）注：注：花粉细胞核内有染色体，染色体主要由花粉细胞核内有染色体，染色体主要由DNADNA和蛋白质组成，和蛋白质组成，醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期
12、还是单核靠边确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期还是单核靠边期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。（二）材料的消毒（二）材料的消毒1 1、花蕾用、花蕾用体积分数为体积分数为70%70%的酒精的酒精浸泡浸泡3030秒秒2 2、无菌水清洗、无菌水清洗3 3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4 4、放入、放入质量分数为质量分数为0.1%0.1%的氯化汞的氯化汞溶液中溶液中2 24 4分钟分钟（也可（也可质量分数为质量分数为1%1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液粉溶液）5 5、无菌水冲洗、无菌水冲洗3 3
13、5 5次次 用于培养花药，实际上多数未熟，由于它用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。花花蕾蕾（7070酒酒精精）大约大约30s30s（无无菌水菌水）清洗清洗（无菌吸无菌吸水纸水纸）吸干水分吸干水分（0.10.1氯氯化汞溶液）化汞溶液）2 24min4min（无无菌水菌水）冲洗冲洗（三）接种和培养（三）接种和培养 灭菌后花蕾，要在灭菌后花蕾，要在无菌条件无菌条件下除去萼片和下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花花瓣，并
14、立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量药时，要尽量不损伤花药不损伤花药（否则接种后，容易从否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织受伤部位产生二倍体的愈伤组织），同时还要彻），同时还要彻底底去除花丝去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成组织或胚状体的形成。通常每瓶通常每瓶接种花药接种花药7-107-10个个，温度控制在，温度控制在2525左右，左右，不需要光照不需要光照。幼小植株形成后才。幼小植株形成后才需要需要光照。光照。一般经过一般经过20-3020-30天培养后，会发现花药开裂，天培养后，会发现花药开裂，长出长出愈伤组织或释
15、放出胚状体愈伤组织或释放出胚状体。将愈伤组织及时。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。株。如果花药开裂释放出如果花药开裂释放出胚状体胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。上，否则这些植株将很难分开。在花药培养中，特别是通过愈在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化现染色体倍性的变化 （四）结
16、果分析与评价（四）结果分析与评价选材是否恰当：选材时实验成功的关键。选材是否恰当：选材时实验成功的关键。要能通过镜检找到适宜发育期的花粉。要能通过镜检找到适宜发育期的花粉。无菌技术是否过关：如果出现了污染现无菌技术是否过关：如果出现了污染现象，说明某些技术操作步骤，如培养基灭象，说明某些技术操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。菌、花蕾消毒或接种等有问题。接种是否成功：如果接种的花药长出愈接种是否成功：如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。植物组织培养技术与花药培养技术的异同点植物组织培养技术与花药培养技术的异同点项目项目相同点相同点不同点不同点植物组织培养技植物组织培养技术术离体的植物组织离体的植物组织经脱分化形成愈经脱分化形成愈伤组织，再分化伤组织，再分化成丛芽，诱导出成丛芽，诱导出根，然后进行移根，然后进行移栽。栽。外植体为体细胞，外植体为体细胞，染色体数无需加染色体数无需加
