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1、2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准胃肠道恶性肿瘤是威胁我国人民生命健康的公共卫生问题之一。良好的实验模型是解析肿瘤发病机制和研发临床治疗新方法的有力工具。高质量的生物医药研究需要实验模型尽可能再现来源组织的生理、病理状态。类器官（Organoid）便是新近发展起来的一种新型实验模型。类器官是指将部分活组织在体外3D培养基中扩增、传代形成的小器官样细胞团。类器官在组织细胞构成、生物学功能及基因组变异谱上均与其来源组织有极高的相似性。类器官具有制备周期短、可以长期低温保藏和可重复使用等诸多优势。近年来，国内外较多机构开展该领域的工作并积累了一定的经验。为了使胃肠道肿瘤研究中类
2、器官相关技术得到有效利用和健康发展，作者以采用常用实验耗材与试剂为例，就类器官构建中组织样本前处理、类器官构建、类器官冻存与复苏、类器官生长状态评估以及类器官质量控制等关键技术提出可参照标准。类器官构建的总原则此标准是基于酶消化法将人胃肠道正常黏膜上皮和胃肠道腺癌组织制备成单个细胞悬液,再将细胞与3D培养支架（此处指基质胶）混合形成3D胶滴,再加入市售的胃肠道上皮专用完全培养基进行培养（类器官专用特定培养基是指含有所培养组织细胞需要的生长因子、细胞因子以及小分子化合物）。其目的是模拟胃黏膜上皮的生长微环境，促使胃肠道干细胞分化成为各种类型的胃肠道黏膜上皮细胞，同时还可维持胃肠道干细胞或多能干细
3、胞的干性，实现体外长期培养、传代目的，便可培养出与胃肠道黏膜组织结构功能类似的活组织类器官。类器官培养中涉及到的供体生物样本来源均以自愿同意参与科学研究为原则，并以签署知情同意书QnfOrmedConSent)为具体体现。主要试验耗材与试剂主要耗材包括24孑麻、1.5mLEP管、15mL离心管、培养皿、50mL离心管、移液管、无菌吸头、冻存管、巴氏吸管、移液器、无菌棉球、银子、组织剪、70100m细胞过滤器(Coming)、细胞程序性冻存盒等。主要试剂包括无动物源性重组胰酶、1%青霉素/链霉素、1%原代细胞抗生素(Primocin)x类器官冻存液CryoStorCSl0、IV型胶原酶、透明质酸
4、酶、Matrigel基质胶。类器官完全培养基由基础培养基及添加的因子组成。基础培养基以AdVanCedDMEM/F12为基础，含有1%青霉素/链霉素、1%原代细胞抗生素、1x4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、IX丙氨酸和L-谷氨酰胺缩合二肽培养基、1B27细胞培养无血清添加剂、1XN2细胞培养添加剂、IonmoI/L胃泌素I和ImmOl/LN-乙酰半胱氨酸、4mmol/L烟酰胺。生长因子与添加物包括：50ng/mL表皮生长因子、200ng/mL纤维母细胞生长因子10、2molLTGFKp制齐IJA-83-01.100ng/mLWnt-3ax500ng/mLR-反应蛋白I(R-SPondin1)、10
5、0ng/mL头蛋白(Noggin)x5molLp38MAPK抑制剂SB202190、1molL前列腺素E2o可选用10molLRHOK抑制剂Y-27632（初次从组织中提取及培养类器官或者类器官状态不佳及类器官复苏时候可使用）。胃肠道黏膜及胃肠道腺癌组织的获取及细胞分离培养由经过培训的医生获取因手术切除的胃肠道黏膜上皮及腺癌组织。肿瘤组织获取时应尽量靠近肿瘤中心，可用剪刀去除肿瘤表面呈黑色或绿色的污染区域，剪取内部灰白色肿瘤组织。为尽量减少肿瘤表面微生物污染，组织各个部位取材应更换剪刀。切取组织块大小大于5mmX5mm,组织离体30min内进行取材。将切取的上述新鲜组织临时放入含有1%青霉素/
6、链霉素和100gmL的原代细胞抗生素的AdvancedDMEM/F12中进行保存，可临时保存6ho若组织需过夜保存，可置于含1%青霉素/链霉素JOOgmL原代细胞抗生素和10molLY276320AdvancedDMEM/F12中保存24ho组织样本需要经过初步清洗与深度清洗过程。初步清洗步骤是：一般是将组织置于不少于5mL的含有1%青霉素/链霉素和100gmL原代细胞抗生素的PBS缓冲液浸泡,每隔510min在振荡器上振荡清洗一次,弃污浊清洗液，加入前述清洗液继续振荡清洗，此步骤不少于4次，总计时长不少于30min。组织的深度清洗步骤是：使用眼科用组织剪在1.5mLEP管中将组织充分剪碎至0
7、.5mmX0.5mm大小，用不少于5mL含有1%青霉素/链霉素和100gmL原代细胞抗生素的PBS缓冲液浸泡，每隔5-10min在振荡器上振荡清洗，1,500r/min离心5min,弃污浊清洗液，加入前述清洗液继续振荡清洗离心，此步骤不少于3次，总计时长不少于30mino单细胞悬液的制备与种板培养向组织沉淀中加入1mL含有IV型胶原酶(1.5mgmL)和透明质酸酶(20gmL),置于37。C水浴锅中消化，每30min使用振荡器上震荡1530s,直至将组织块消化成絮状粘稠状，消化时长为1.52h将消化好的组织液充分转移至15mL无菌离心管中,加入5mL的AdvancedDMEM/F12培养基进行
8、稀释，同时轻轻吹打数次。用70100m细胞过滤器将上述液体进行过滤，去除消化后的残渣，保留细胞过滤液至新的15mL无菌离心管中(此步骤为可选项，如果不进行细胞过滤，可使用滴管吸除肉眼可见的大块组织残渣),将离心管置离心机离心(1,500r/min5min),弃上清，保留沉淀物。类器官种板原则是细胞悬液与基质胶按照1:1混合。根据细胞沉淀的多少选择重悬AdvancedDMEM/F12培养基的量，一般加5080L的培养基进行细胞重悬，并充分混匀。再加等量(5080L)的Matrigel基质胶充分混匀(注意，在吹打过程中切忌产生大量气泡，过多的气泡会导致基质胶和培养基混合体贴壁不牢而脱离24孔板底部
9、，致使实验失败)。种板之前的操作在冰盒上进行,以避免常温下基质胶发生凝固。将5080L的混合液向24孔板种板，上述一次实验一般可获得23复孔的种板量。种板后将24孔板放入37。C培养箱孵育2030min,待基质胶充分凝固后加入类器官培养基(500800L),向其余空白孔内加入适量的PBS以减少类器官培养基在孵育过程中的液体挥发。种板后置37。C培养箱孵育,一般在培养的第2天就可以在倒置显微镜下观察到长出的类器官小球，随着培养时间延长，类器官小球会慢慢变大。类器官的传代与冻存类器官培养到一定的数目及大小时(2周左右)，即可进行类器官的传代和冻存。将24孔板中的培养基吸出，加入1mL的PBS清洗1
10、遍。去除PBS后加入1mL的无动物源性重组胰酶消化。每隔1015min中吹打1次直至类器官被消化成单个细胞悬液(12h),加入1mL的AdvancedDMEM/F12培养基与蛋白酶混合，移至15mL离心管中1,500r/min离心5mino去除上清,将离心沉淀中的1/3细胞进行传代培养，用50-80L的AdvancedDMEM/F12培养基重悬细胞，再加入5080L的Matrigel基质胶充分混匀，分别吸取5080L的混合液做2复孑闲板培养。将离心沉淀中的剩余2/3细胞做低温冻存。向细胞中加入1mL类器官冻存液CryoStorCS10形成细胞悬液，分别各取500L移至2个低温冻存管中，置程序性
11、冻存盒内零下80。C深低温冰箱中暂时保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。类器官的复苏先将水浴锅温度调至37oC从液氮罐中取出冻存管快速放入37。C水浴锅中，摇动令其尽快融化。取出冻存管，用移液枪将液体吸至15mL无菌离心管中，力口入10倍体积的AdvancedDMEM/F12培养基混匀，1,500r/min离心5min,去除上清,保留沉淀。加入5080L的AdvancedDMEM/F12培养基重悬细胞，再加入5080L的Matrigel基质胶充分混匀，分别吸取50-80L的混合液做2复孔培养。类器官的生长状态与质量鉴定D台盼蓝染色法评估细胞活力台盼蓝染色是传统的活细胞质量控制染色方法，死
12、亡细胞膜可被染料穿透而着色但活细胞不能被染色而呈透亮的胞质。将离心后的细胞沉淀用100LAdvancedDMEM/F12培养基重悬，吸取18L细胞悬液加入2L的0.4%台盼蓝染液孵育3mino吸取10L细胞悬液匀速加入血细胞计数板，在倒置显微镜分别计数四大格中未染成蓝色和染成蓝色的细胞总数,计算每100L体积中细胞总数和细胞存活率。2）类器官组织切片制备与HE染色类器官组织切片的制备可基于冰冻包埋法或石蜡包埋切片法。冰冻包埋法是将生长状态良好的类器官吸去培养基，使用刀片将包含基质胶的类器官球刮取到OCT包埋剂中，零下80。C冷冻12h制备6m冰冻切片。石蜡包埋切片法是将生长状态良好的类器官吹散
13、,L500r/min离心5min,吸去上清，加入4%多聚甲醛固定30min,用10%琼脂糖富集细胞后进行石蜡包埋，以8m厚度进行切片做HE染色。活力较差的类器官表现为细胞排列紊乱，胞质内出现空泡性改变。3）衰老相关B-半乳糖苜酶染色衰老相关砰乳糖甘酶染色（-Gal）主要用于评估细胞老化状态。将类器官消化成细胞悬液0.51h,用B-Gal染色固定液室温固定15min,PBS洗涤3次按照B-Gal染色试剂盒说明加入B-Gal染色工作液37。（:孵育过夜,次日显微镜下观察拍照。衰老的细胞被-Gal染成绿色。衰老细胞比例大于80%可判断为高度衰老状态，难以进行后续传代培养。4）人工智能辅助类器官活力评
14、估将培养至第10天的类器官培养皿置于倒置显微镜下，在40倍物镜下拍摄类器官亮视野图像。采用类器官图像训练AI算法构建了CBAM-Y0L0v3目标检测模型，该模型可以自动输出类器官数目、类器官平均直径、衰老类器官和活力类器官的占比情况。5）胃肠上皮相关生物标志物的表达鉴定采用前述类器官的冰冻切片或者石蜡包埋切片进行生物标志物的检测。一般采用免疫荧光或者免疫组化方法。胃上皮源性指标物主要有CKl9、CK20、CDH1或者HK+ATPaseo以SMA肌源性指标作为阴性对照，上皮细胞几乎不表达SMAo肠上皮标志物主要有CK7、CK20、CDX2、MUC2、CEA或者TFF3。以SMA肌源性指标作为阴性对照，上皮细胞几乎不表达SMAo结论本标准是在大量实践经验基础上提出的胃肠上皮及肿瘤类器官构建相关的基本参照基准。该标准尚不涉及上皮细胞与微环境成分共培养问题，也不涉及类器官芯片制备相关问题。
