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1、第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术光学显微镜技术（light microscopy） 电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope ) 第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 离心分离技术离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方
2、法细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术放射自显影技术 定量细胞化学分析技术定量细胞化学分析技术第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术 细胞的培养细胞的培养 细胞工程细胞工程 一、光学显微镜技术（一、光学显微镜技术（light microscopy) 普通复式光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 激光共焦扫描显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术（Laser
3、 Confocal Microscopy） 相差显微镜相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC）二、二、 电子显微镜技术电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识电子显微镜的基本知识电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术主要电镜制样技术负染色技术负染色技术冰冻蚀刻技术冰冻蚀刻技术超薄切片技术超薄切片技术电镜三维重构技术电镜三维重构技术 扫描电镜扫描电镜（Scanning electron mi
4、croscope，SEM） SPM(Scanning probe microscope)三、三、 扫描遂道显微镜扫描遂道显微镜Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：包括：STMSTM、AFMAFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等、磁力显微镜、摩擦力显微镜等原理原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原
5、子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。系统。特点：（特点：（1 1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为（侧分辨率为0.10.10.2nm0.2nm，纵分辨率可达，纵分辨率可达0.01nm0.01nm）；）；（2 2）可实时得到样品表面三维图象
6、，可测量厚度信息；）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3 3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。（4 4）可连续成像，进行动态观察）可连续成像，进行动态观察用途：纳米生物学研究领域中的重要工具用途：纳米生物学研究领域中的重要工具, ,在原子水平上揭示样本表面的结构。在原子水平上揭示样本表面的结构。 光镜样本制作光镜样本制作分辨率分辨率是指区分开两个质点间的最小距离是指区分开两个质点间的最小距离荧光显微镜技术荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）原理与应用原理与应用 直接荧光标记技术直
7、接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位：等生物大分子的定性定位： 如绿色荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)的应用的应用 激光共焦扫描显微镜技术激光共焦扫描显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）原理原理应用：应用：排除焦平面以外光的干扰，增强排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率图像反差和提高分辨率(1.41.7)， 可重构样品的三维结构。可重构样品的三维结构。相差显微镜相差显微镜（phase-contrast microscope）将光程差或相位差转
8、换成振幅差，可用于将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞观察活细胞 微分干涉显微镜微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究 活细胞中较大的细胞器活细胞中较大的细胞器录像增差显微镜技术录像增差显微镜技术（video-enhance microscopyvideo-enhance microscopy） 计算机辅助的计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研
9、究活显微镜可在高分辨率下研究活 细胞中的颗粒及细胞器的运动细胞中的颗粒及细胞器的运动电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较 显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700） 紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术主要电镜制样技术 超薄切片技术超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备用
10、于电镜观察的样本制备示意图示意图 负染色技术负染色技术（Negative staining）与）与金属投影金属投影 染色背景，衬托出样品的精细结构染色背景，衬托出样品的精细结构冰冻蚀刻技术（冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。和膜表面结构。 快速冷冻快速冷冻深度蚀刻技术深度蚀刻技术（quick freeze deep etchingquick freeze deep etching）电镜三维重构技术电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算
11、机图象处理相结合而形成的电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合，是当前结构生物学分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural BiologyStructural Biology） 主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 扫描电镜扫描电镜原理与应用原理与应用：电子电子“探针探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，扫描，激发样品表面放出二
12、次电子，探测器收集二次电子成象。探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题力问题一、一、 离心分离技术离心分离技术 用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心差速离心：分离密度不同的细胞组分：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离：精细组分或生物大分子的分离二、二、 细胞内核酸、蛋白质、细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法酶、糖与脂类等的显示方法原理原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基
13、团特异性结合的特征，通过显特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的判断某种物质在细胞中的分布和含量分布和含量。 Feulgen Staining三、特异蛋白抗原的定位与定性三、特异蛋白抗原的定位与定性 免疫荧光技术免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图图） 蛋白电泳蛋白电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE) 与免疫印迹反应与免疫印迹反应(Western-Blot)(Western-Blot) 免疫电镜技术免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术免疫铁蛋白技术免疫酶标
14、技术免疫酶标技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等定位等四、细胞内特异核酸的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针）（同位素标记或荧光素标记的探针） 电镜水平的原位杂交技术电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） PCR技术技术 五、放射
15、自显影技术五、放射自显影技术原理及应用：原理及应用：利用同位素的利用同位素的放射自显影放射自显影，对细胞内生物大分子进行，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：步骤：前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记）前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） 放射自显影放射自显影六定量细胞化学分析技术六定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度术细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质利用细胞内某些物质对特异光谱
16、的吸收，测定这些物质 （如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：包括： 紫外光显微分光光度测定法紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪流式细胞仪（Flow Cytometry）主要应用主要应用：用于定量测定细胞中的用于定量测定细胞中的DNADNA、RNARNA或某一特异蛋白的含量；或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离分离DNADNA含量不同的中期染色体。含量不同的中期染色体。 一、细胞的培养一、细胞的培养 动物细胞培养动物细胞培养 类型：原代培养细胞（类型：原代培养细胞（primary culture cellprimary culture cell） 继代培养细胞（继代培养细胞（sub-culture cellsub-culture cell） 细胞株（细胞株（cell straincell strain） 正常二倍体，接触抑制正常二倍体，接触抑制 细胞系细胞系（cell
